ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 12.11.2024
Просмотров: 35
Скачиваний: 0
Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.
Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 - 350В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.
Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов.
Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.
Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно однодольных.
Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.
Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
Клонирование и экспрессия генов в эукариотических клетках.
У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.
Для эукариотической клетки характерно:
Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.
Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.
Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:
а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза.
б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;
в) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;
г)терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.
Использование генетической инженерии в животноводстве.
В качестве вектора чаще всего используются вирусы. Они легко проникают в клетку и встраиваются в ДНК путем обычной инфекции. При помощи вирусов осуществляют трансформацию в 40% случаев. В 25% используют липосомы. В остальных случаях – другие методы. Все генно-инженерные работы с животными можно разделить на 2 категории: работа с соматическими клетками и работа с половыми клетками.
Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих
Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Хотя культуры клеток животных, особенно при массовом выращивании, гораздо менее экономичны, чем бактериальные дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом - способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков - продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек - обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.
Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.
Культуры клеток млекопитающих могут оказаться эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо при помощи техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, а плазмида вводится организм путем обыкновенной инъекции.
ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.
Развитие злокачественной опухоли в организме обычно подавляет иммунитет. Проблема в том, чтобы подхлестнуть иммунную систему в целом и направить ее действие против раковых клеток. Исследователи из Медицинской школы в Энн-Арборе (Мичиган) придумали метод борьбы с раком. В опухолевые клетки толстой кишки подопытных мышей ввели гены, кодирующие белки другой линии мышей. Это можно осуществить с помощью липосом или вируса. После появления на внешней стороне клеточной мембраны этих белков иммунная система атаковала такие клетки. 20% больных мышей выздоровели, у 70% опухоль уменьшилась, в контрольной группе все умерли. Лимфоциты боролись не только с «меченными» клетками опухоли, но и клетками метастаз, следовательно, иммунная система «проснулась». В настоящее время ведутся эксперименты на людях с раком кожи.
Генетическая трансформация половых клеток животных.
Если вводить ДНК в клетки сформированного организма, изменится лишь небольшое число клеток. В этом случае животное будет химерным, т.е. разные ткани будут иметь разный генотип. Дя изменения свойств всего организма, необходимо изменить геном половых кл или зиготы.
Чаща всего для этого применяют метод микроинъекции ДНК в один или оба ронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки. Далее зиготы имплантируют суррогатным матерям. Родившимся мышатам делается мол-ген анализ после чего есть шанс выведения чистых линий трансгенных животных. Недостатком метода является его трудоемкость и малая эфективность.
Введение ген конструкции в ЭСК. ЭСК получают из брастоцист, когда число бластомер не превышает 8. они обладают тотипотентностью. Модифицированные клетки культивируют ин витро, после чего вводят в другой эмбрион и имплантируют суррогатной матери. Так же есть возможность выведения чистых линий. При помощи этого метода есть возможность контроля экспрессии гена в бластоцисте, соответственно эффективность метода повышается.
По статистике, получается одно модифицированное животне из 40 зигот мышей, 100 зигот овцы или козы, 1500 зигот коровы. И из полученных животных лишь 50% экспрессируют трансгенный белок или сособны передавать этот ген потомству.
Применение трансгенных животных
Трансгенных животных с введенными вирусными или клеточными онкогенами используют для изучения канцерогенеза.
Возможность получения мышей, мутантных по любому клонированному гену, позволяет исследовать функцию генов. Иногда мутация проявляется по-разному у мышей и у человека, что дает возможность исследовать особенности биологии организмов. Если же мутация проявляется сходным образом, то мутантные мыши представляют удобную модель для изучения патогенеза болезни и методов ее лечения.
Мутантных мышей используют для установления роли наследственных факторов в развитии полигенных болезней, например атеросклероза, и для исследования функции нервной системы.
Крупных трансгенных животных используют для производства препаратов, которые выделяют из молока или крови.
Для выращивания и пересадки органов человеку.
Получение биологически активных соединений на основе методов генной инженерии:
получение инсулина;
получение соматотропина;
получение интерферона.
В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.