Файл: Диплом начисто.doc

Министерство образования и науки Российской Федерации

Московский Государственный Гуманитарный Университет имени М.А. Шолохова

Факультет экологии и естественных наук

Выпускная квалификационная работа студентки 6 курса очно-заочного отделения экологии и естественных наук факультета

Теняновой Варвары Александровны

на тему

«Транскриптомный анализ генов контроля генеза митохондрий и реактивности иммунной системы при действии адаптогенов»

Научный руководитель: Нурбеков М.К. Рецензент: Допущена к защите:

Москва - 2012

Содержание

Введение 3

Цель 5

Задачи 5

Глава 1. Обзор литературы 7

1.1.Мышцы. Состав и пластичность 8

1.2.PGC-1 коактиваторы 11

PGC-1 и окислительный метаболизм 13

PGC-1 и типы волокон 14

PGC-1 и физические упражнения 16

PGC-1 и ангиогенез 19

PGC-1 и болезнь 22

1.3.Актуальные направления 25

Глава 2. Материалы и методы 27

2.1. Культивирование клеток 27

2.2. Выделение РНК 28

Выделение РНК из клеточной культуры набором «YellowSolve» 29

2.4. Методика ПЦР 30

Проведение процедуры обратной транскрипции 30

Проведение процедуры полимеразной цепной реакции 32

Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле. 33

Результаты 34

Выводы 34

Список использованных источников 34

Список сокращений??

Введение

Основными органоидами энергетического обмена в животных клетках являются митохондрии. Их количество повышается при регулярной физической нагрузке. Этот процесс можно наблюдать в тканях скелетных мышц, сердечной мышце, печени, жировой и нервной ткани. При длительной гиподинамии происходит обратный процесс, в результате которого могут развиться такие заболевания как ожирение, диабет второго типа, атеросклероз и другие заболевания сердечно-сосудистой системы. В самом деле, физическая активность является одной из основных предпосылок для крепкого здоровья.

В силу вышесказанного, понимание молекулярных путей, лежащих в основе биогенеза митохондрий, представляет большой интерес. Значительный прогресс в раскрытии молекулярных механизмов, регулирующих синтез митохондрий был достигнут за последнее десятилетие. PGC-1 коактиваторы, по-видимому, играют ключевую роль, т.к. они запускают каскад процессов биогенеза митохондрий, и тем самым представляют большой интерес с точки зрения мышечной биоэнергетики. PGC-1α и PGC-1β очень сильно регулируют широкий спектр базовых генетических программ контроля обменных процессов, в том числе активацию окисления жирных кислот, окислительное фосфорилирование, а также многочисленные сопутствующие активности, необходимые для поддержания функций митохондрий. Непосредственный механизм действия коактиватора PGC-1α заключается в активации закодированных в ядре генов, вовлеченных в биогенез митохондрий через активацию не менее трех транскрипционных факторов. Эти факторы взаимодействуют и активируют регуляторные локусы у многих митохондриальных генов, закодированных в ядре. Гены окисления жирных кислот, который является в значительной степени митохондриальным процессом, регулируются через коактивацию ядерного PPARa рецептора. PGC-1α также активирует экспрессию митохондриальных факторов транскрипции. Эти факторы являются ключевыми регуляторами пролиферации и транскрипции митохондриального генома. Для поддержания функциональности большинства тканей организма необходимо поддерживать на оптимальном высоком уровне активность митохондрий, которые особенно подвержены повреждениям и являются основным источником оксидативного стресса в клетках и организме. Как уже отмечалось, ключевым регулятором биогенеза и функций митохондрий является ген PGC-1α и его белковый продукт.

Эффективный контроль биогенеза митохондрий критически важен для поддержания уровня продукции энергии, предотвращения эндогенного окислительного стресса и, в конце концов, для замедления старения организма. Следовательно, исключительно важным является поиск различных биологически активных соединений и препаратов, способных тканеспецифически активировать указанный ген на различных уровнях и, в зависимости, от выявляемых тонких механизмов активирующего действия препаратов рекомендовать их для различных целей общей или специфической активации функций митохондрий и регуляции энергетического метаболизма в клетках, тканях и организме человека.

В соответствии с вышесказанным, в планируемой работе, с целью поиска подходов к специфической модуляции гена PGC-1α, мы планировали решение серии взаимосвязанных задач методического и методологического плана. В частности, предполагалось освоение методик культивирования клеток человека для постановки in vitro экспериментов, методик получения чистых и недеградированных препаратов РНК, пригодных для дальнейших молекулярно-генетических процедур, включая ПЦР и ПЦР в реальном времени. В конечном этапе дипломной работы предполагается проведения пробного in vitro эксперимента по воздействию выбранного перечня биологически активных препаратов (трекрезан, кверцетин, амарант, дигидрокверцетин) на функциональную активность гена PGC-1α по продуцируемой в культивируемых клетках специфической мРНК

Цель

Провести всесторонний анализ регуляторной роли гена PGC-1α в контроле метаболических процессов, отработать и оптимизировать методики получения препаратов РНК из культуры клеток, а также изучить возможные подходы к специфической модуляции гена PGC-1α, при действии различных биологически активных соединений.

В частности предполагалось освоение методик культивирования клеток человека для постановки invitroэкспериментов, методик получения чистых и недеградированных препаратов РНК, пригодных для дальнейших молекулярно-генетических процедур, включая ПЦР и ПЦР в реальном времени. В конечном этапе дипломной работы предполагается проведения пробногоinvitroэксперимента по воздействию выбранного перечня биологически активных препаратов (трекрезан, кверцетин, амарант, дигидрокверцетин) на функциональную активность гена PGC-1α по продуцируемой в культивируемых клетках специфической мРНК

Задачи

1. Подробный анализ роли гена PGC-1α в регуляции энергетических обменных процессов в различных тканях и влияние вариаций гена на склонность к распространенным патологиям.

2. Отработка и отладка методик получения препаратов и РНК, пригодных для ПЦР-анализа из культур клеток

3. Освоение и оптимизация методик анализа активности гена PGC-1αчерез специфическую мРНК.

4. Предварительный анализ характера воздействия распространенных биологически активных соединений и адаптогенов на уровень активности гена PGC-1α.

Глава 1. Обзор литературы

Мышцы преобразуют химическую энергию в физическую работу. Перечень физических активностей выполняемых мышцами широко варьирует, начиная от быстрого подъема тяжестей, заканчивая постоянной, без сбоев и нарушений, перекачкой крови в течение десятилетий. Более того, эти задачи меняются с течением времени. Чтобы приспособиться к этим меняющимся условиям, мышцы имеют разнообразный состав и обладают высокой пластичностью: состав и функции мышц могут адаптироваться к внешним факторам, таким как различные виды выполняемой активности или гормональным воздействиям. Это верно как в норме, так и при патологии. Упражнения на выносливость, например, делают мышцы более адаптированными к окислительным обменным процессам и последние становятся более устойчивыми к утомлению. И наоборот, неупотребление и системные катаболические патологии приводят к атрофии, сопровождающейся глубокой потерей мышечной функции. В силу вышесказанного, понимание молекулярных путей, лежащих в основе этой пластичности, представляет большой интерес.

Изменения в программах обмена веществ лежат в основе мышечной пластичности. Большой прорыв был сделан в течение последнего десятилетия в понимании молекулярных путей, которые направляют эти изменения. Транскрипционные коактиваторы PGC-1, в этой связи, представляют большой интерес с точки зрения мышечной биоэнергетики, потому что эти белки являются доминантными регуляторами окислительного метаболизма во многих тканях. PGC-1α и PGC-1β очень сильно регулируют широкий спектр базовых генетических программ контроля обменных процессов, в том числе активацию окисления жирных кислот, окислительное фосфорилирование, а также многочисленные сопутствующие активности, необходимые для поддержания функций митохондрий. Этот обзор будет посвящен роли PGC-1 коактиваторов в регуляции метаболизма мышц и обеспечения их пластичности.

1. Мышцы. Состав и пластичность

Скелетные мышцы приобретают большую часть своей гетерогенности в процессе развития. Мышцы состоят из тысяч волокон, каждое из которых представляет собой синцитий сотен клеток простирающихся от одного сухожилия к другому. Физические активности, которые выполняют группы волокон или мышц колеблются от непрерывной, низкоуровневой активности, такой как поддержание позы, до внезапных всплесков интенсивной активности. Для достижения таких разнообразных функций, в мышцах существуют волокна с различными биоэнергетическими и биофизическими свойствами [1,2]. Есть четыре преобладающих типа волокон у скелетных мышц взрослых мышей: I, IIA, IIX и IIB, названных в соответствии с видами тяжелых цепей миозина (МНС), которые первично экспрессируются в мышцах. АТФазы миозина управляют кинетикой актин/миозинового механизма сокращений, а также активностью вспомогательных саркомерных белков и белков сарколеммы, которые регулируют потоки ионов кальция в волокнах, MHC, таким образом, определяют биофизические свойства волокон. Волокна MHC типа IIB, исторически называются «быстрыми гликолитическими» (FG) волокнами, и способны к быстрым и мощным сокращениям, обеспечивая быстрые вспышки активности. Это происходит за счет высоких уровней потребления АТФ, и больших и быстрых потоков ионов кальция. Волокна MHC типа I, исторически названные «медленными окислительными» (SO) волокнами, с другой стороны, обеспечивают более медленные физические активности типа сокращение/релаксация, которые являются более энергетически эффективным. Волокна Типа I также богаты комплексом митохондриальных сетей, что способствует преимущественному окислению жирных кислот, это является гораздо более эффективным источником АТФ, нежели анаэробный гликолиз. Волокна типа IIA и IIX, названные исторически «быстрыми окислительно-гликолитическими" (FOG) волокнами, имеют промежуточные биофизические свойства, но, как правило, также склонны быть окислительными и поэтому они богаты митохондриями.

Мышцы, содержащие преимущественно волокна типа I, IIA, и IIX волокна, таким образом, способны поддерживать стабильное снабжение АТФ, сохранять запасы гликогена, и обеспечивают устойчивость к утомлению. Эти мышцы, такие как камбаловидная и глубокие икроножные, обеспечивают постоянные, но маломощные активности, такие как простое движение. И наоборот, мышцы богатые волокнами типа IIB, такие как поверхностные четырехглавые мышцы быстро устают, но обеспечивают быстрые и мощные сокращения, полезные для спорадических всплесков интенсивной работы. У некоторых организмов, различные типы волокон распределены между отдельными мышцами. У птиц, например, окислительные волокна находятся почти исключительно в задних конечностях, где наблюдаются высокие концентрации миоглобина и цитохромов, что делает эти волокна красными (или коричневыми при кулинарной обработке и, следовательно, называются "темным мясом"). У наземных млекопитающих, более глубоко расположенные части мышц, как правило, богаче в содержании окислительных волокон, в соответствии с их ролью в ходьбе.

Хотя базовый состав типа волокон мышц во многом определяется во время развития, зрелые мышцы сохраняют высокий потенциал пластичности [1,2]. Физическая активность, или отсутствие таковой, имеют особенно сильное значение. Тренировка на выносливость вызывает увеличение содержания митохондрий, значительную активацию ангиогенеза, и переключение типа волокон «быстрые-медленные». Это приводит к улучшению выносливости и повышенной устойчивости к утомлению, что характерно, например, для марафонцев. Силовые тренировки, с другой стороны, вызывают значительную гипертрофию мышц, трансформацию типа волокон «медленные-быстрые», и переключение на использование гликолиза как предпочтительного источника энергии. Эти эффекты воспроизводились в течение длительного периода филогенеза, хотя степень пластичности значительно варьировалась в зависимости от вида организма и реализуемой программы физической активности.

Серия элегантных, и теперь классических экспериментов, показала, что нервная регуляция является основным фактором, определяющим преобразования типов волокон [3]. Когда двигательные нервы, иннервирующих быстрые и медленные волокна взаимно заменяются, фенотипы волокон обращаются в течение нескольких недель (в том числе состав волокон и содержания митохондрий). Кроме того, тоновые низкочастотные электрические импульсы нервовьбыстро сокращающихся мышц приводят к превращению волокон по типу «быстрые-медленные». Таким образом, амплитуда и частота электрической стимуляции являются основным фактором, определяющим идентичность волокон. При этом, различные другие сигналы, прежде всего активность тироидных гормонов, накладываются друг на друга.