Файл: Диплом начисто.doc

3. Актуальные направления

Многие оставшиеся без ответа вопросы явно требуют к себе внимания. Хотя многие маршруты могут быть связаны с экспрессией или активностью PGC-1а или активности, которые из них действуют в скелетных мышцах в ответ на внешние сигналы, пока неясно. Например, как лишение кислорода и питательных веществ индуцирует PGC-1a, а именно то какие маршруты индуцируют PGC-1а во время упражнений остается лишь отчасти понятным. Как PGC-1а интегрирует эти многочисленные поступающие сигналы, также нуждается в дальнейшем исследовании. Например, недостаток кислорода / питательных веществ каким-то образом вызывает индукцию PGC-1 и активирует ее ангиогенные программы, но не биогенез митохондрий. Пост-трансляционная модификации PGC-1, вероятно, играют важную роль. Предполагается что роль PGC-1а в тренировке выносливости заключается в индукции ангиогенеза и биогенеза митохондрий и преобразования типов волокон, что также ожидает официального подтверждения. Наконец, воздействия, которые производит PGC-1a на мышцы, по-видимому, имеют существенное влияние на отдаленные ткани, и что представляют собой эти эффекты, и как происходит взаимное сообщение органов, только начинают рассматриваться. Возможно, особенно заманчивой является противовоспалительная роль PGC-1 [41].

Несмотря на множество безответных вопросов, ясно то, что мощные способности PGC-1a и P к перепрограммированию многочисленных аспектов функционирования скелетных мышц. Улучшение физической формы, индукция ангиогенеза и защиты от атрофии и дистрофии особенно важны. Способность PGC-1 к комплексному управлению крупных программ экспрессии генов делает их привлекательными узловыми точками для фармацевтического вмешательства. Например, клинические испытания на человеке, использования VEGF для лечения хронической ишемии нижних конечностей дали неутешительный результат [33], вероятно, отчасти потому, что VEGF в одиночку не способна генерировать полностью функциональные сосуды. PGC-1a, с другой стороны, по-видимому активирует полномасштабную и комплексно управляемую программу ангиогенеза, включая индукцию VEGF а также ряд ангиогенных факторов, таких как ангиопоэтин 2 и PDGFB [32]. Таким образом, независимо от своей роли в обеспечении физиологичной мышечной пластичности, препараты, которые индуцируют какой либо из коактиваторов PGC-1, могут улучшить множество мышечных патологий, от периферических патологий сосудов до миодистрофии Дюшенна. Интенсивные исследования подобных препаратов усиленно осуществляются.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Культивирование клеток

Реактивы:

1. Среда для культивирование DMEM

2. Фосфатно-солевой буфер

3. 0,05% раствор трипсина

4. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

5. РНК-сохраняющий раствор EverFresh

Оборудование:

Ход работы:

Культивация клеток проводилась в испытательной лаборатории биологической активности и токсикологической безопасности ОАО «Завод экологической техники и экопитания ДИОД»

Для получения образцов РНК использовалась культура клеток Hela. Клетки HeLa культивировали в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (+37⁰С, 5% СО₂) в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см² (посевная концентрация 1х10⁶ клеток/флакон).

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывали фосфатно-солевым буфером без ионов кальция и магния, после чего заливали на 5 минут 0,05% раствором трипсина (1 мл раствора на флакон). Затем инактивировали трипсин средой для культивирования клеток DMEM, осторожно пипетировали клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждали центрифугированием (5 мин 400g). После этого клетки еще 2 раза отмывали в охлажденном растворе фосфатно-солевого буфера и ЭДТА (+4°С).

Жизнеспособность клеток оценивалась окраской 0,4% трипанового синего. Суспензию клеток разводили до концентрации 1х10⁷ кл/мл (подсчет клеток осуществлялся в камере Горяева). Хранение клеток возможно при температуре +4°С не более 3 часов.

Для лучшего сохранения РНК суспензия клеток заливалась тройным объемом раствора EverFresh.

2.2. Выделение рнк

Выделение РНК и ПЦР проводились в лаборатории экологического биомониторинга МГГУ им. М.А.Шолохова.

Работа проводилась в резиновых перчатках во избежание попадания Рназ кожи рук в препараты ДНК.

Стеклянная посуда была прокалена при +160⁰С в течении 4часов. Пластиковая посуда автоклавировалась в дистиллированной воде.

Клетки для исследования транспортировались в РНК-сохраняющем растворе EverFresh в соотношении 1:3. Перед началом выделения РНК клетки осаждались центрифугированием, супернатант удалялся.

Выделение рнк из клеточной культуры набором «YellowSolve»

Реактивы:

1. Лизирующий раствор YellowSolve

2. Хлороформ

3. Депротеинизирующий раствор GгееnСlеап

4. Этиловый спирт 96%

5. Этиловый спирт 80%

Оборудование:

Ход работы:

Суспензию культуры клеток гомогенезировали в 1 мл лизирующего раствора YellowSolve до полного исчезновения комочков клеточного материала. 100мкл суспензии содержали приблизительно10млн клеток.

Лизат центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и пр. Прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку.

К супернатанту добавляли 0.1 мл хлороформа, после чего энергично перемешивали смесь на вортексе и оставляли на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивалось на две фазы. По истечении 20 минут центрифугировали пробирку 5 минут при 12 тыс. об/мин. Образовывалось 2 слоя жидкости. Верхний слой переносили в чистую пробирку, т.к. в нем содержалась РНК. К отобранному верхнему слою добавляли равный объем депротеинизирующего фенолсодержащего раствора GгееnСlеап и энергично встряхивали смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин.

После центрифугирования снова переносили верхний слой жидкости, содержащей РНК в чистую пробирку, замеряя её объем. Добавляли двойной объем 96%-ного этанола и хорошо перемешивали содержимое пробирки. После чего пробирка помещалась в штатив на 20-30 минут при температуре -20⁰С для формирования осадка РНК. РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин, после чего отбирался спиртовой супернатант и осторожно, по стенке пробирки, к осадку РНК добавляли 0,5мл 80%-ного этанола. Снова РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин. Спиртовой супернатант максимально удалялся из пробирки

Все дальнейшие процедуры проводились при температуре +4⁰С. Растворяли осадок РНК в воде, затем отбирали аликвоту и определяли концентрацию РНК спектрофотометрически. Оценивали нативность РНК электрофорезом в 1.2-1.5%-ной агарозе, приготовленной на х1-ном ТВЕ и содержащей 0.3 мкг/мл бромистого этидия.

Препарат РНК можно хранить замороженным в воде при температуре –20⁰С или ниже. Предпочтительно хранение в виде спиртового осадка при температуре –20⁰С

2.4. Методика пцр Проведение процедуры обратной транскрипции

На этом этапе в результате проведения процедуры обратной транскрипции мы получали полноразмерную первую цепь комплиментарной ДНК (кДНК) из выделенной ранее матрицы мРНК.

В качестве праймера были выбраны случайные гексонуклеотиды. Они неспецифически связываются на мРНК, нарабатывая короткие кДНК практически по всей матрице мРНК. Такие праймеры подходят для изучения всей последовательности мРНК, особенно 5` район.

Реактивы:

1. M-MLV обратная транскриптаза

2. х10-кратный ОТ буфер для фермента

3. 2,5 mM смесь dNTP

4. Гексапраймеры

5. Вода, свободная от Рназ

Ход работы:

Все манипуляции проводятся на льду, т.е. при температуре +4⁰С.

В пробирке смешали 5 мкл полученной ранее мРНК, 1мкл случайного гексапраймера и довели объем смеси до 18 мкл водой, свободной от РНаз. Перемешивали и осаждали капли кратковременным центрифугированием.

Смесь инкубировалась 5 минут при +70⁰С, после чего пробирка переносилась в лед. Капли собирались кратковременным центрифугированием.

На льду в пробирку добавляли следующие компоненты: 0,5мкл M-MLV обратной транскриптазы, 2,5мкл х10-кратного ОТ буфера для фермента, 4мкл 2,5mM смесь dNTP. После чего смесь инкубировалась сначала 10 минут при температуре +25⁰С, затем в течении 1 часа при температуре +37⁰С. Реакция останавливалась путем нагревания смеси до +70⁰С на протяжении 10 минут, после чего смесь переносили в лед.

Синтезированная кДНК может быть сразу использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Кроме того, полученный материал можно хранить при температуре –20⁰С и ниже. Мы проводили ПЦР в день выделения РНК и синтеза кДНК, для того чтобы максимально сохранить полученный материал.