Файл: MУ_бел.doc

Принцип метода.В щелочной среде в присутствии солей меди растворы белка приобретают фиолетовый цвет с красным или синим оттенком, зависящим от количества пептидных связей в молекуле. Продукты неполного гидролиза белка, содержащие не менее двух пептидных связей, дают биуретовую реакцию с красным оттенком. Реакция обусловлена наличием пептидных групп, которые в щелочной среде образуют с ионами двухвалентной меди окрашенные комплексы.

В щелочной среде пептидная группа присутствует в своей таутомерной енольной форме:

Ион меди взаимодействует с отрицательным зарядом диссоциированной в этих условиях ОН-группой – возникает солеобразная связь; кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Комплексное соединение меди с енолизованными пептидными группами при участии четырех атомов азота можно представить следующим образом:

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 10%-ного раствора NаОН и по одной капле 1%-ного раствора сульфата меди. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Развивается фиолетовое окрашивание с соответствующим оттенком.

Нингидриновая реакция

Принцип метода.Белки, полипептиды, как и свободные-аминокислоты, дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином (гидрат трикетогидриндена). Реакция характерна для-аминогрупп аминокислот.

На Iстадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования (образованиеNН₃) и декарбоксилирования (образование СО₂)-аминокислот:

Окисленный Восстановленный

нингидрин нингидрин

На IIстадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570нм) пропорциональна количеству аминокислоты:

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 0,5%-ного раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 минуты в пробирках появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.

Ксантопротеиновая реакция

Принцип метода. При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты белок выпадает в осадок, который при нагревании растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. Эта реакция характерна для ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофона), которые подвергаются нитрованию:

Нитропроизводное аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет. Например:

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. Затем в пробирки добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и нагревают (осторожно!). При нагревании раствор и выпавший белый осадок или муть от свернувшегося белка окрашиваются в ярко-желтый цвет при наличии ароматических аминокислот: в пробирке с желатином появляется едва заметное бледно-желтое окрашивание (обусловленное незначительной примесью других белков). Пробирки охлаждают, после этого в них осторожно добавляют по 10 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия. Выпавший в начале осадок белка растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Реакция Адамкевича

Принцип метода.При добавлении к раствору белка небольших количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание. Эта реакция характерна для триптофана, который в кислой среде вступает в реакцию с альдегидами с образованием окрашенных продуктов конденсации. Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, которая всегда содержит следы глиоксиловой кислоты:

Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 2–3 капли глиоксиловой кислоты и по 5 капель ледяной уксусной кислоты. Раствор слегка нагревают, охлаждают и по стенке пробирки осторожно (подслаивая) приливают 10 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости при наличии триптофана наблюдается красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню.

Реакция Фоля

Принцип метода. Добавление к раствору белка крепкой щелочи и уксуснокислого свинца при кипячении приводит к потемнению раствора. Реакция обусловлена присутствием в белке серосодержащих аминокислот (цистеина и метионина). Эти аминокислоты при нагревании в присутствии щелочи разрушаются, образуя сернистый натрий:

Уксуснокислый свинец реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:

(СH₃COO)₂ + NaOH Pb(ONa)₂ + 2CH₃COOH

Сернистый натрий при взаимодействии с плюмбитом образует черный осадок сернистого свинца:

Na₂S + Pb(ONa)₂ + 2 H₂O PbS + 4NaOH

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью –

5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия и по 1 капле 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Содержимое пробирок подвергают кипячению.

Материалы и реактивы:разбавленный раствор яичного альбумина (см. приложение Б, п.1); 1% раствор желатина; раствор растительного альбумина(cм. приложение Б, п.2.); 10%, 30% растворы гидроксид натрия; 1% раствор сульфата меди; 0,5% раствор нингидрина; азотная кислота концентрированная; уксусная кислота, ледяная; глиоксиловая кислота (см. приложение Б, п.3); серная кислота (d=1,84); 5% раствор уксуснокислого свинца.

Оборудование:пробирки; капельницы; спиртовки; водяная баня.

Контрольные вопросы

1. Назовите универсальные реакции на белки.

2. Укажите специфические реакции на аминокислоты.

3. Какие аминокислоты называются незаменимыми? Каково их строение?

4. Что такое аминокислотный скор?

5. По каким принципам классифицируются аминокислоты?

Физико-химические свойства белков
1. Определение изоэлектрической точки белков

Белки, благодаря присутствию в их составе аминных и карбоксильных групп, существуют в растворах в виде заряженных частиц.

В зависимости от количества в белке аминных и карбоксильных групп его молекула в водном растворе приобретает положительный или отрицательный заряд. Большинство белков животного происхождения содержат в своем составе больше дикарбоновых аминокислот и поэтому они заряжаются отрицательно (белки-анионы). Некоторые белки содержат в своем составе значительные количества диаминокислот и поэтому заряжаются положительно (белки-катионы). Одноименный заряд молекул способствует взаимному отталкиванию частиц, что обеспечивает устойчивость их в водном растворе.

Число ионизированных групп в белке может быть увеличено или уменьшено при изменении рН среды. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильных групп, и отрицательный суммарный заряд белковой молекулы уменьшается. Наоборот, в щелочной среде подавляется ионизация аминных групп, и положительный суммарный заряд белка уменьшается. При определенном значении рН число положительных зарядов на поверхности белковой молекулы будет равным числу отрицательных зарядов, и в целом заряд частицы белка станет равным нулю. Состояние белка, при котором суммарный заряд его равен нулю, называется изоэлектрическим состоянием. рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, обозначается рl. В изоэлектрической точке за счет равенства зарядов ослабляются силы отталкивания между белковыми частицами, что благоприятствует агрегации белковых молекул и выпадению белка в осадок, т.е в изоэлектрической точке раствор белка неустойчив, белок теряет один из факторов стабилизации - заряд.

При добавлении щелочи или кислоты к белку, выпавшему в осадок в изоэлектрическом состоянии, наступает перезарядка его молекул, и белок вновь растворяется.

Принцип метода.В нескольких пробирках с помощью ацетатных буферов создают растворы с различными значениями рН среды. Затем во все пробирки добавляют гидрофильное соединение, отнимающее у белка гидратную оболочку, удерживающую его в растворе. По пробирке с наиболее обильным осадком белка определяют значение рН, соответствующее изоэлектрической точке.

Ход работы.Для определения изоэлектрической точки желатина в пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты, уксуснокислого натрия, раствора желатина и этилового спирта в соотношениях, указанных в таблице 1. После перемешивания в каждой пробирке раствор имеет определенное значение рН и степень мутности. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу1.

В графике «степень мутности» отсутствие осадка обозначают знаком (-), наличие осадка – знаком (+), значительное помутнение – несколькими плюсами.

Таблица 1  Основные параметры опыта и его результаты

№ пробирки	Состав буферной смеси, мл		рН смеси	0,5% раствор желатина, мл	Этиловый спирт, мл	Степень мутности
	0,1 н СН₃СООН	0,1 н СН₃СООН
1	1,8	0,2	3,8	1,0	4,0
2	1,4	0,6	4,4	1,0	4,0
3	1,0	1,0	4,7	1,0	4,0
4	0,6	1,4	5,1	1,0	4,0
5	0,2	1,8	5,7	1,0	4,0