Файл: MУ_бел.doc

Выпадение белков в осадок при добавлении к их растворам нейтральных солей – NаСl, КСl,Nа₂SO₄, (NН₄)₂SО₄, МgSO₄в высоких концентрациях называетсявысаливанием.

Принцип метода. Высаливание основано на снижении степени гидратации белковых молекул вследствие связывания молекул воды с ионами соли. Лишенные (полностью или частично) гидратной оболочки белковые молекулы агрегируют, слипаются и выпадают в осадок.

Ход работы. В пробирку наливают 2–3 мл неразбавленного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпавший осадок глобулинов отделяют фильтрованием и вместе с фильтром помещают в стакан, где предварительно находится небольшое количество воды.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до полного насыщения (последняя порция соли не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который тоже отделяют от раствора фильтрованием и помещают в тот же стакан, где находится фильтр с глобулинами.

С фильтратом проводят биуретовую реакцию. Если произошло полное высаливание белков, то она должна быть отрицательной.

Отбирают из стакана, где находятся фильтры осадками альбуминов и глобулинов, небольшое количество раствора в пробирку и проводят биуретовую реакцию, она должна быть положительной – это доказывает обратимость процесса высаливания.

Материалы и реактивы:неразбавленный яичный белок; насыщенный раствор сернокислого аммония; сернокислый аммоний, тонко растертый порошок; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор сернокислой меди.

Оборудование: пробирки обыкновенные; мерные пипетки на 5 мл; воронки, бумажные фильтры.

Контрольные вопросы

1.Почему белки являются амфолитами?

2.Что такое изоэлектрическая точка белков?

3.Как заряжаются белки в кислой и щелочной среде?

4.Является ли изоэлектрическое состояние обратимым?

5.Практическое использование изоэлектрического состояния белков.

6.Как можно изменить количество положительных и отрицательных зарядов на поверхности белковой молекулы?

7.Для чего добавляют спирт при определении изоэлектрической точки?

Необратимое осаждение белков

При необратимом осаждении белков нарушается их четвертичная, третичная и вторичная структуры, т.е. белки денатурируют. В результате денатурации белки утрачивают свои физико-химические и биологические свойства.

Денатурация белков может быть вызвана радом физических и химических факторов: повышением температуры, взаимодействием с солями тяжелых металлов, минеральными кислотами, щелочами, продолжительным воздействием органических реагентов и др. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев наблюдается ренатурация – восстановление исходной конформации молекулы белка и его свойств.

Осаждение белков органическими веществами

Добавление смешивающихся с водой нейтральных органических растворителей, например этанола, ацетона, хлороформа снижает растворимость большинства белков в воде и вызывает выпадение их в осадок. Органические растворители снижают диэлектрическую постоянную белковых растворов, вследствие чего усиливается притяжение между белковыми частицами, способствующее агрегации белков и снижению их растворимости. Кроме того, органические растворители нарушают гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы.

Кратковременное воздействие на белки органическими растворителями при низких температурах вызывает их обратимое осаждение. Однако длительное воздействие высоких концентраций органических растворителей при относительно высоких температурах (+20⁰С и выше) приводит к денатурации белков, необратимому осаждению.

Ход работы: 1) К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2 мл 96%-ного этилового спирта, раствор встряхивают. Выпадает осадок белка.

2) К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2 мл 80%-ного ацетона, раствор встряхивают. Выпадает осадок белка.

Результаты наблюдений заносят в таблицу 2.

Денатурация белков при нагревании

Белки денатурируют и выпадают в осадок при нагревании их растворов выше 50-60⁰С. Свернувшиеся белки не могут быть снова переведены в раствор, т.к. при нагревании нарушаются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и вторичную структуры белковых молекул, изменяются их физико-химические свойства, также снижается и гидратационная способность.

В изоэлектрическом состоянии при нагревании степень денатурации увеличивается, т.к. изоэлектрическая точка для большинства белков находится в слабокислой среде, то небольшое подкисление раствора белка способствует более полной его коагуляции.

Устойчивость белковых мицелл наблюдается в сильнокислой или щелочной среде даже при кипячении, так как молекулы белка, заряжаясь одноименно, отталкиваются друг от друга.

Добавление к сильнокислому раствору белков нейтральных солей при нагревании способствует осаждению белков вследствие дегидратирования их частиц.

Ход работы: 1) В пять пробирок вносят по 2 мл раствора яичного альбумина.

2) Белок в первой пробирке нагревают до кипения. Появляется осадок белка.

3) Во вторую пробирку добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок выпадает быстрее, так как белок находится ближе к изоэлектрическому состоянию.

4) Добавляют в третью пробирку 0,5 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется даже при кипячении.

5) В четвертую пробирку прибавляют 0,5 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, несколько капель насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Образуется осадок белка.

6) В пятую пробирку прибавляют 0,5 мл 10%-ного раствора едкого натра и нагревают. Осадок белка не образуется и при кипячении.

Результаты наблюдений заносят в таблицу 2.

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Концентрированные минеральные кислоты (Н₂SO₄, НСl, НNО₃и др.) вызывают необратимую денатурацию белков, следствием чего является агрегация белковых молекул и их осаждение.

Денатурирующее действие минеральных кислот объясняется их воздействием на функциональные группы белка. Минеральные кислоты, например, превращают отрицательно заряженную группу –СОО^в незаряженную –СООН, что приводит к нарушению ионных связей (солевых мостиков) и, как следствие, к разворачиванию полипептидных цепей. При длительном воздействии концентрированными минеральными кислотами могут произойти гидролиз белка, а также реакции нитрования, окисления, сульфирования и т.д.

Ход работы.К 1 мл концентрированной Н₂SO₄осторожно,под тягой,по стенке пробирки добавляют 1 мл раствора яичного альбумина так, чтобы не смешивать жидкости.

На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При осторожном смешивании жидкостей осадок не исчезает.

Результаты заносят в таблицу 2.

Осаждение белков органическими кислотами

Белки из растворов необратимо осаждаются органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота (ТХУ) ССl₃СООН и сульфосалициловая кислота С₆Н₃ОНСООНSО₃Н являются очень чувствительными, специфическими реактивами на белок и широко применяются с этой целью.

Осаждение белков ТХУ часто применяют для полного удаления (осаждения) белков из биологических жидкостей.

Ход работы.В одну пробирку вносят 1 мл раствора белка и добавляют несколько капель 10%-ного раствора ТХУ. Выпадает осадок.

В другую пробирку вносят 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок белка.

Результаты вносят в таблицу 2.