Файл: Белки_2003.doc

5. Осаждение белков солями тяжелых металлов

При действии небольших концентраций солей тяжелых металлов (Рb⁺², Аg⁺¹, Аs⁺³, Нg⁺², Сd⁺², Вi⁺³и т.д.) на растворы белка происходит денатурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием не растворимых в воде комплексных соединений. Кроме того, тяжелые металлы нейтрализуют электрический заряд и изменяют четвертичную, третичную и вторичную структуры макромолекул белка, образуя связи между функциональными группами молекул.

Существуют определенные границы концентраций солей тяжелых металлов, при которых комплекс белка с солью тяжелого металла переходит в осадок либо находится в растворимом состоянии.

Ход работы.К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в избытке (7-10 мл) раствора этой соли.

Результаты наблюдений заносят в таблицу 2.

Таблица 2  Результаты наблюдений

Исследуемый материал	Денатурирующий фактор и его воздействие	Наблюдения

Материалы и реактивы:раствор яичного альбумина 1% (см. приложение Б, п.4); 10%-ный раствор уксусной кислоты; 10%-ный растворNаОН; 96%-ный этиловый спирт;80%-ный ацетон;концентрированные кислоты Н₂SO₄, НСl, НNО₃;1%-ный раствор сульфата меди;10%-ный раствор ТХУ; насыщенный растворNаСI.

Оборудование:пробирки обыкновенные; пипетки на 1–2 мл; спиртовка.

Контрольные вопросы

1.Что такое денатурация белка?

2. Какие Вы знаете денатурирующие факторы и каков механизм их действия?

3. Какие структуры белковых молекул изменяются при денатурации?

4. Является ли денатурация обратимым процессом?

4. Разделение и очистка белков методом диализа

Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупронецаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большой молекулярной массой, не способны проникать через полупронецаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны). При этом низкомолекулярные частицы (органические и неорганические) легко проходят через поры полупроницаемых мембран.

---

Диализ широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (соли, сахара и других), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Прибор, в котором проводят диализ, называется диализатором. Целлофановый или коллодиевый мешочек, опущенный в сосуд с водой, представляет простейший диализатор (рис.1). Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану в воду.

Методом диализа можно разделить альбумины и глобулины. При переходе солей из белкового раствора в окружающую среду глобулины будут выпадать в осадок, т.к. они не растворимы в водной среде, а альбумины будут оставаться в растворе. Простейшим диализатором может служить целлофановый мешочек, опущенный в стакан с водой. Солевой раствор белка помещают в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ (ионы соли) диффундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка.

Белок +

(NН₄)₂SО₄

2 NН₄⁺ SО₄^2-

Н₂О

Рисунок 1Схема диализатора

Ход работы. 10–15 мл раствора яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония, помещают в целлофановый мешочек и погружают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке совпадал с уровнем воды. Для ускорения диализа необходимо менять воду в сосуде. Через 1 час анализируют воду из стакана: в одной пробирке проводят биуретовую реакцию и убеждаются, что белки через мембрану не проходят; в другой пробирке проводят реакцию на ион SO₄^2-, добавлением нескольких капель 10%-ного раствора ВаСI₂для установления проникновения соли через стенку целлофанового мешочка. Через 2–3 часа отмечают появление осадка глобулинов внутри мешочка, который отфильтровывают. В фильтрате остаются белки альбуминовой фракции.

Глобулиновую природу белков осадка доказывают растворением его в растворах солей (10%-ный раствор хлористого аммония, хлористого натрия и др.) При разбавлении раствора водой вновь выпадает осадок.

Альбуминовую природу белков фильтрата подтверждают разбавлением водой с отсутствием осадка или полным насыщением сернокислым аммонием (выпадает осадок).

Материалы и реактивы:раствор яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония (см. приложение Б, п.5); 10%-ный раствор хлористого бария; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор медного купороса; 10%-ный раствор хлористого аммония; сернокислый аммоний, тонко измельченный.

---

Оборудование: пробирки обыкновенные; целлофановый или коллодиевый мешочек; химический стакан или сосуд на 1–2 мл;пипетки мерные на 10 мл; пипетки.

Контрольные вопросы

1. Принцип процесса диализа.

2. Устройство простейшего диализатора.

3. Для каких целей применяется диализ?

4. Почему методом диализа можно отделить глобулины (солерастворимые белки) от глобулинов (водорастворимые белки)?

5. Как доказать глобулиновую и альбуминовую природу белков при их разделении?

6. Реакции, используемые для доказательства протекания процесса диализа.

---

4. Методы определения азота в биологических объектах

   1. Количественное определение общего азота по методу Кьельдаля

Наиболее распространенным методом определения общего азота в биологическом материале является метод Кьельдаля. Основное его достоинство заключается в том, что он позволяет определить суммарный азот с высокой точностью. Несмотря на ряд модификаций, которые претерпел метод за свою историю, он, сохранив специфичность, стал стандартным методом определения азота. Однако из-за того, что отдельные участки его трудно поддаются автоматизации, метод и в настоящее время остается довольно трудоемким и длительным.

Принцип действия. При определении общего азота по Кьельдалю органическое вещество минерализуют при высокой температуре концентрированной серной кислотой. При этом органическое вещество окисляется в присутствии катализатора до СО₂ и Н₂О, а весь азот переходит в аммиак и связывается с серной кислотой, образуя сульфат аммония:

Азотосодержащее [О]

органическое (NН₄)₂SО₄ +СО₂ + Н₂О

соединение Н₂SO₄

Раствором щелочи нейтрализуют избыток серной кислоты и высвобождают из сернистого аммония аммиак:

(NН₄)₂SО₄ + 2NаОН Nа₂SО₄ + 2 NН₃ + 2 Н₂О,

который затем отгоняется с парами воды и улавливается стандартным раствором борной кислоты.

При взаимодействии аммиака и кислоты образуется борат аммония NН₄Н₂ВО₃:

NН₃ +Н₃ВО₃ NН₄⁺ + Н₂ВО₃^-

Борат титруют стандартным раствором серной кислоты, причем избыток Н₃ВО₃не мешает определению:

Н⁺ + Н₂ВО₃^- Н₃ВО_3.

Отгон аммиака давлением водяных паров и титрование ведут на приборе конструкции В.М. Сереньева (см. рисунок 2), где можно совместить две заключительные стадии с целью ускорения определения азота.

Используемые для сжигания исследуемого материала катализаторы должны содержать сернокислый калий для повышения температуры сжигания вещества до оптимального значения.

---

Из-за трудоемкости процедуры выделения белка в анализируемой практике часто определяют так называемый сырой белок (сырой протеин), используя данные по содержанию общего азота (белкового и небелкового), считая его условно белковым. Так как содержание азота в белках колеблется в довольно широких пределах, а в среднем составляет 16%, то для пересчета азота на белок часто берут усредненный коэффициент – 6,25 (100:16 = 6,25). Этот коэффициент не является постоянным и в зависимости от содержания азота в белке у разных культур может изменяться от 5,3 до 6,25. Например, для пшеницы, ржи используют коэффициент 5,7 (100:17,5= 5,7). В целях получения сравнимых данных необходимо обязательно указывать коэффициент пересчета (Nумножить на коэффициент пересчета).

Ход работы.0,3- 0,5 г исследуемого воздушно-сухого материала отвешивают в маленькой пробирке (0,5х3 см), которую затем вставляют в резиновую трубку нужного диаметра и переносят в колбу Кьельдаля, вводя пробирку почти до основания перевернутой вверх дном колбы и опрокидывая всю систему. По разности масс пробирки с навеской и пустой пробирки (после переноса) определяют массу навески для анализа. В колбу добавляют 0,5 ± 0,05г смешанного катализатора и приливают цилиндром или дозатором 10 мл концентрированной Н₂SO₄. Перемешивают содержимое колбы (без встряхивания), закрывают ее стеклянной полой грушевидной втулкой или воронкой и ставят в наклонном положении (примерно 45⁰) в гнездо нагревателя в вытяжном шкафу. Колбу осторожно нагревают, снимая или уменьшая нагрев на некоторое время каждый раз, когда обугливаемое вещество начинает сильно пениться от выделяющихся газов, в том числе оксида серы (IV). После прекращения вспенивания можно усилить нагрев до слабого непрерывного кипения. Ввиду возможных потерь азота, вследствие разложения бисульфата аммония (сернокислый аммоний разлагается на аммиак и бисульфат при 355⁰С) необходимо следить, чтобы в процессе сжигания горло колбы всегда оставалось холодным, а также за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось темных пятен, смывая их горячей кислотой, придав колбе наклонное положение. Когда содержимое колбы приобретает зеленовато-голубой цвет без желтого оттенка, ее кипятят еще около 20 минут, после чего в охлажденную на воздухе колбу добавляют небольшое количество воды для удаления следов кислоты со стеклянной втулки и внутренней стороны верхней части колбы, закрывают колбу резиновой пробкой или герметизируют другим способом и оставляют до определения азота. Отгон аммиака производят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

---