Файл: Белки_2003.doc

1 – реакционный сосуд ; 2 – воронка; 3 – барботер; 4 – сосуд со щелочью; 5 – бюретка; 6,7 – спускные краны; 8 – кран на свободный доступ воздуха; 9 – ЛАТР; 10 – штатив; 11 – электроды

Рисунок 2 – прибор Сереньева для определения азота

Методика работы на приборе Сереньева. После заполнения бюретки титрованным раствором до нулевой отметки, подачи воды к водоструйному насосу и холодильнику барботера 7 и подключения электродов подготовленного к работе сосуда через ЛАТР 9 в сеть закрывают краны в следующей последовательности: нижний барботера 7, затем верхний, сообщая барботер с реактором 8 и, наконец, кран реактора 6. В барботер 3 вносят из бюретки 5 примерно 1/4 часть (1-2 мл) предполагаемого для титрования стандартного раствора 0,02н серной кислоты, содержащей индикатор Гроака.

В реактор 1 через фиксированную воронку подают минерализованный образец, обеспечив полноту переноса и отсутствие следов кислоты на воронке дистиллированной водой. При этом следят за тем, чтобы объем перенесенной жидкости был как можно меньшим, поскольку в этом случае время анализа уменьшается. Осторожно добавляют 33%-ный раствор гидроксида натрия до почернения смеси (работают в защитных очках).

Поступление аммиака с парами воды из реактора в барботер должно сопровождаться синхронным добавлением титрованного раствора (обеспечивается вручную) до границы перехода окраски в барботере с зеленой до лиловой (промежуточная окраска – сероватого тона). Постоянство лиловой окраски в течение 20–60 с (временный интервал зависит от скорости отгонки) свидетельствует о конце титрования. В бюретке отмечают объем израсходованного стандартного раствора и показание заносят в лабораторный журнал.

При необходимости продолжить работу после очередного измерения (например, проведение холостого опыта после анализа испытуемого образца или наоборот) уменьшают нагрев, открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор - барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7). После слива жидкости из барботера и реактора промывают фиксированную воронку последнего дистиллированной водой (до 50 мл). Затем краны закрывают в обратной последовательности, заполняют бюретку стандартным раствором – и прибор вновь готов к работе.

По окончании работы отключают ЛАТР, открывают кран реактора 6, затем верхний кран барботера 8. После истечения жидкости из реактора промывают фиксированную воронку водой, закрывают верхний кран барботера 8, затем кран реактора 6 и заполняют реактор водой. Вновь открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор – барботер (верхний кран 6,8) – барботер (нижний кран 7) – предохранительная склянка. Отключают насос и перекрывают водопроводную воду для охлаждения. После слива жидкости из реактора и барботера извлекают подвижную часть затвора (пробку) крана, промывают кран водой, просушивают, смазывают борным вазелином и собирают кран.

Расчет содержания азота на сухое вещество в исследуемом материале проводится по формуле

, (2)

где N– содержание азота в пересчете на сухое вещество, %;

V- количество титрованного раствора 0,02н Н₂SО₄, израсходованного на титрование за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная нормальность титрованного раствора;

k - поправка на нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

W – влажность исследуемого вещества, %;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см³.

Расчет содержания азота на воздушно - сухое в исследуемом материале проводится по формуле

, (3)

где N– содержание азота в пересчете на воздушно-сухое вещество, %;

V– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная н - нормальность титрованного раствора;

k – поправка на н - нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

0,014 – титр1н раствора серной кислоты по азоту, г/см³.

Содержание белка рассчитывают путем умножения полученных значений азота на соответствующий коэффициент пересчета.

Материалы и реактивы:зерно, мука, солод; концентрированный раствор серной кислоты; 33%-ный раствор гидроксида натрия; смешанный индикатор Гроака (см. приложение Б, п.6); титрованный 0,02н раствор серной кислоты с индикатором Гроака и борной кислотой (см. приложение Б, п.7); селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8).

Оборудование:колбы Кьельдаля; универсальная индикаторная бумага; цилиндры на 5, 10 мл; стеклянные втулки, воронки; пипетки на 20 мл; стаканы на 100 мл; промывалки; бумажные фильтры; пробирки с резиновой трубкой; прибор Сереньева для отгонки аммиака, защитные очки.

Определение различных форм азота в молоке и сыре

Наличие различных форм азота в молоке и сырах различного вида может служить критерием их качества и контролем за правильностью хода технологического процесса. Например, повышенное или пониженное содержание различных форм азота в цельном молоке может служить, наряду с другими методами биохимического и микробиологического анализа, критериями состояния фальсификации молока. Изменения в содержании различных форм азота в созревающих сырах может служить основой для заключения о степени нарушения технологического процесса, наличия в активной в протеолитическом отношении посторонней микрофлоры, нарушения температурного режима созревания сыров, правильности хода вкусо- и ароматообразования в сырах и т.д. Например, повышенное содержание белковых соединений в молоке при параллельном снижении содержания жира в нем и нормальной плотности может указывать на фальсификацию молока, заключающуюся в удалении сливок при параллельном внесении обрата. Нормальное содержание белка при нормальной плотности и пониженном количестве жира может указывать на наличие в молоке липолитической активности посторонней микрофлоры и т.д.

Степень распада белков при созревании сыров определяют, исследуя содержание в них отдельных фракций азотистых оснований. Белки под влиянием сычужного фермента и ферментов молочнокислых бактерий сырной массы распадаются с образованием многочисленных азотистых соединений сыра. При распаде белков в сырах накапливаются пептиды и свободные аминокислоты, существенно влияющие на вкус готового продукта. В первой половине созревания в сырах вследствие образования большего количества пептидов с различной молекулярной массой появляется горький привкус, затем по мере гидролиза пептидов он обычно исчезает. В процессе созревания твердых сыров суммарное количество аминокислот непрерывно увеличивается, а концентрация других, достигнув максимума, снижается. В сырах часто отсутствует аргинин, серин и метионин. Уменьшение количества или исчезновение некоторых аминокислот свидетельствует о дальнейшем их распаде или превращениях в новые аминокислоты, большинство из которых под действием дегидрогиназ, декарбоксилаз, трансаминаз и других ферментов микроорганизмов дезаминируется, декарбоксилируется, вступает в реакцию переаминирования и подвергается другим изменениям.

Образующийся в результате ряд химических соединений играет большую роль в формировании вкуса и аромата сыра: карбоновые кислоты, окси- и кетокислоты, альдегиды, кетоны, амины, азотистые гетероциклы.

В предлагаемой работе студенты получают различные образцы молока и по содержанию белка, молочного жира и плотности делают заключение о возможной фальсификации молока исходя из того, что среднее содержание жира в молоке составляет 3,5±0,5%, величина плотности “Д” находится в пределах от 28 до 30С.

При определении состояния различных форм азота в анализируемых образцах сыра студент при завершении анализов должен сделать заключение о нормальности или ненормальности хода созревания сыров. А также уметь объяснить возможные причины возникновения этих процессов, исходя из того, что средние величины для мягких и твердых сыров со сроком созревания от 1,5 до 2 месяцев должны быть следующими (в % к общему азоту): общий растворимый азот 22-67; растворимый небелковый азот – от 5 до 8; азот пептидов, аминокислот, амидов, аммиака – от 4 до 6; азот полипептидов 1- 2.

Азотистые соединения сыра

(общий азот)

__________________________________________

Нерастворимые в воде азотистые Растворимые в воде азотистые

соединения (азот нерастворимый) соединения (общий растворимый азот)

Растворимые белковые вещества - Растворимые небелковые вещества –

азотистые соединения, осаждаемые азотистые соединения, не осаждаемые уксусной и трихлоруксусной кислотой уксусной и ТХУ кислотой

(растворимый белковый азот) (растворимый небелковый азот)

Растворимые азотистые соединения, Растворимые азотистые

осаждаемые танином и спиртом соединения, не осаждаемые

(азот пептидов) танином и спиртом

(азот аминный и аммиачный)

Рисунок 3 -Разделение азотистых соединений сыра

Метод определения общего количества азота в сыре

Ход работы.Отвешивают с точностью до 0,001 г 2 г пробы сыра, переносят ее в фарфоровую ступку и тщательно растирают, постепенно приливая небольшими порциями 50 мл 1%-ного раствора нейтрального, лимоннокислого натрия, нагретого до 35-40⁰С. Полученный раствор переливают в мерную колбу на 100 мл через воронку, обмывая ступку, пестик и воронку раствором лимоннокислого натрия, охлаждают до 20⁰С и доводят водой до метки.

В колбу Кьельдаля емкостью 250 мл отмеривают пипеткой 5 мл приготовленного раствора (это соответствует 0,1 г сыра и сжигают его с 5-7 мл селенового катализатора). Во избежание сильного вспенивания жидкости при нагревании в колбу Кьельдаля вносят несколько кусочков твердой обожженной глины (кусочки кирпича, керамики и пр.) Колбу под углом 40⁰помещают в вытяжной шкаф на асбестовую с электрическим нагревом сетку. Во избежание выкипания и разбрызгивания жидкости в горло колбы Кьельдаля вставляют стеклянную грушу или небольшую воронку, выходящие пары воды и серной кислоты конденсируются на ней и стекают обратно. Это позволяет избежать потерь при сжигании.

Вначале нагревание ведут осторожно, а затем, удалив асбестовые сетки, сильно нагревают до полного исчезновения темной и бурой окраски. Сжигать белковые вещества следует не менее двух часов. Прозрачная жидкость после сжигания примет зеленоватый или слегка желтоватый оттенок с совершенно белым осадком и нагревание колбы продолжают еще час. Содержимое колбы охлаждают до 20 ⁰С, добавляют 10 мл воды и содержимое переносят в аппарат для отгонки аммиака. После этого колба ополаскивается еще два раза по 3 мл дистиллированной водой. Промывные воды тоже переносят в аппарат для отгонки аммиака. Отгонку аммиака проводят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

Количество азота рассчитывают по формуле

,(4)