ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.09.2025
Просмотров: 267
Скачиваний: 0
ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.
5.7 Практическое применение ИФА.
ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:
• массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);
• выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;
• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;
• выявления иммунных комплексов;
• выявления онкомаркеров;
• определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);
• определения общего IgE и специфических IgE антител;
• скрининга моиоклональных антител;
• определения цитокинов в биологических жидкостях.
Чувствительность метода
ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов.
В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА – 10-9 – 10-12 моль.
6. Иммунофлюоресцентный анализ.
Иммунофлюоресценция — люминесценция (свечение) при микроскопии в ультрафиолетовом спектре биологического объекта, предварительно обработанного меченными флюорохромом антителами. Иммунофлюоресценция разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспресс-диагностики инфекционных болезней.
Принцип иммунофлюоресцентного метода (реакции иммунофлюоресценции – РИФ) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флюорисцирующих специфических антител с гомологичным антигеном. Образующийся при этом, комплекс антиген-антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа (приложение 2). Таким образом, с помощью РИФ реализуется непосредственный контроль за первой фазой серологических реакций, причем специфичность метода сочетается с высокой чувствительностью. Предложено и применяется несколько вариантов реакции иммунофлюоресценции:
A. Прямая реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – для её выполнения используют непосредственно специфические антитела, меченные флюорохромом.
B. Непрямая реакция иммунофлюоресценции (РНИФ) – для её выполнения используют видоспецифические (против антител человека или животных) иммуноглобулины, меченные флюорохромом.
Постановка РИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 370С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-210С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы.
Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «+++» и «+++» – очень яркая и яркая; «++» и «+» – выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.
Постановка РНИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют (химические фиксаторы, лучше ацетон), наносят на них иммунную специфическую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 370С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-210С). Для удаления избытка специфических антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Затем наносят на них антитела к иммуноглобулинам животного, при иммунизации которого была полученная использованная на первом этапе иммунная специфическая сыворотка, меченные флюорохромом, взятые в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) при температуре 370С на 20-30 минут (на 25-40 минут при температуре 18-210С). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течение 10 минут. Сушат при комнатной температуре и исследуют в люминесцентном микроскопе или в обычном микроскопе с люминесцентной приставкой, с использованием масляной иммерсионной системы (например, МИКМЕД 2вар.11).
Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырех плюсовая шкала: «+++» и «+++» – очень яркая и яркая; «++» и «+» – выраженная и слабая ободочная, зеленая флюоресценция клеток.
Примеры реагентов: линия MONOFLUOKIT “Sanofi Pasteur” (Франция), выявление антигена - индикация возбудителей: аденовирусов, циомегаловируса, криптоспоридий, вирусов гриппа и вирусов парагриппа, ВИЧ 1 - 2, герпесвирусов 1 - 2, вирусов бешенства, респираторно-синцитиального вируса, легионелл, хламидий, микоплазм, уреаплазм, трепонем, риккетсий, плазмодий малярии, пневмоцист и токсоплазм. Отечественные реагенты РИФ для определения иерсиний чумы, псевдотуберкулеза, бруцелл, вирусов полиомиелита, вирусов гепатита А,Е,В,С,D, вирусов клещевого энцефалита , лихорадки денге и крымской геморрагической лихорадки, вируса бешенства. Диагностические наборы «С.Т.Д.-тест», для определения возбудителей инфекций, передаваемых половым путем: С.Т.Д.-тест- уреаплазма, С.Т.Д.-тест- микоплазма, С.Т.Д.-тест хламидия.
Серологические реакции с использованием специфических антител меченных флюорохромами прочно вошли в практику экспресс - диагностики вирусных и бактериальных инфекций, широко используются в идентификации микроорганизмов. Время исследования 1,5-2 часа.
7. Радиоиммунологический анализ (риа).
В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).
Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИА проста и включает следующие основные этапы:
А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.
Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.
В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:
1. К реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например полиэтиленгликоль.
2. К реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.
В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.
Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.