Файл: 005 lec bio.pdf

Получение

продуцентов

продолжение...

1

Получение кДНК для клонирования

2

Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках

3

Введение рекомбинантной ДНК в организм-реципиент

Особенности пермиссивных клеток:

•1. Внутриклеточные нуклеазы не разрушают включаемую ДНК или РНК.

•2. Вектор способен реплицироваться в пермиссивной клетке.

•3. Выраженная активность промотора и/или терминатора транскрипции рДНК.

•4. Сплайсинг РНК.

•5. Наблюдается эффективная трансляция мРНК.

•6. Нет выраженной активности пептидогидролаз, катализирующих гидролиз экспрессируемых чужеродных белков.

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются методами трансформации, инфекции, микроинъекций, электропорации. Ввод рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией.

4

Электропорация

25 мкФ = 2500 В

при 200 Ω за 5 мс

Импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость мембран.

На клетку действуют высоковольтным импульсом. Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.

5

Бомбардировка (баллистическая трансформация)

1)ДНК с целевыми генами, адсорбируется на поверхности микрочастиц (0,6-6 мкм) из инертных металлов -- золота или вольфрама.

2)Частицам сообщается кинетическая энергия, достаточная для прохождения через клеточные стенки.

3)Оказавшись внутри клетки, ДНК с поверхности частиц высвобождается в цитоплазму

6

Микроинъекции

•Механическое введение ДНК в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений.

•Игла стеклянная диаметром 0,1 мкм

Ооциты лягушки

7

Ферменты

8

Ферменты

Ферменты (от лат. fermentum – закваска), энзимы, специфические белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Почти все биохимические реакции, протекающие в любом организме и в своём закономерном сочетании составляющие его обмен веществ, катализируются соответствующими ферментами.

9

Ферменты

Ферменты проявляют все свойства белков, их активность зависит от сохранения нативной пространственной структуры. При глубоких изменениях конформации, приводящих к денатурации, ферменты утрачивают активность. Для ряда ферментов показано, что утрата активности при денатурации является обратимой. На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен впервые четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами; так, например, уреаза (при рН 8.0) способна ускорять гидролиз мочевины в 1010 раз.

10

Ферменты: история открытия

В1814 рус. химик К. Г. С. Кирхгоф открыл ферментативное действие водных вытяжек из проросшего ячменя, расщеплявших крахмал до сахара. Можно считать, что эти работы положили начало энзимологии (ферментологии) как самостоятельному разделу биологической химии. В 1833 французскими химиками А. Пайеном и Ж. Персо впервые был выделен из солода препарат фермента амилазы, что способствовало развитию препаративной химии ферментов.

Всередины 19 в. разгорелась дискуссия о природе брожения между Л. Пастером, с одной стороны, и Ю. Либихом, П. Э. М. Бертло и К. Бернаром – с другой.

11

Ферменты: история открытия

Дискуссия Либиха и Пастера о природе брожения была разрешена в 1897 Э. Бухнером, который, растирая дрожжи с инфузорной землёй, выделил из них бесклеточный растворимый ферментный препарат (названный им зимазой), вызывавший спиртовое брожение. Открытие Бухнера утвердило материалистическое понимание природы брожений и имело большое значение для дальнейшего развития как энзимологии, так и всей биохимии.

12

Ферменты: история открытия

В конце XIX века на базе достижений в области изучения структуры органических соединений биологического происхождения стало возможным изучение специфичности ферментов. В это время Э.Фишером было выдвинуто знаменитое положение о необходимости стерического соответствия между ферментом и субстратом (вещество, на которое действует фермент); по его образному выражению

"субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку".

13

Ферменты: номенклатура

Ранее при наименовании ферментов, в частности, гидролитических, за основу часто брали наименование субстрата (группы субстратов) и добавляли суффикс "аза". Так появились названия отдельных ферментов, например, аргиназа (фермент, гидролизующий аргинин), и групп ферментов -- протеиназы, липазы, карбогидразы. По сходному принципу получили наименование ферменты, катализирующие окислительные реакции; при этом за основу брали название реакции и добавляли тот же суффикс "аза"; например, группа ферментов, переносящих водород, получила название "дегидрогеназы"; а дегидрогеназа молочной кислоты (лактата) была названа "лактатдегидрогеназа".

Некоторые давно открытые ферменты получили специальные названия, например, трипсин, пепсин.

14

Ферменты: номенклатура

Международный биохимический союз рекомендовал классификацию, в которой ферменты сгруппированы в 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

1.Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции).

2.Трансферазы (реакции переноса функциональных групп).

3.Гидролазы (реакции гидролиза).

4.Лиазы (реакции отщепления групп негидролитическим путем).

5.Изомеразы (реакции изомеризации).

6.Лигазы (реакции синтеза за счет энергии АТР).

15

Ферменты: номенклатура

В пределах классов ферменты группируются в подклассы и подподклассы в соответствии с особенностями катализируемых реакций; на этой основе (с учетом названия субстратов) базируется кодовая нумерация (шифры) ферментов и их систематические названия. Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками чисел; первое число показывает, к какому из шести классов относится фермент; второе и третье числа показывают подкласс и подподкласс, соответственно, а четвертое число -- порядковый номер фермента в его подподклассе.

Х.Х.Х.Х

Например, кислая фосфатаза имеет шифр 3.1.3.2; это означает, что она относится к классу гидролаз (3), подклассу этих ферментов, действующих на сложноэфирные связи (3.1), к подподклассу ферментов, гидролизующих моноэфиры фосфорной кислоты (3.1.3), и что порядковый номер фермента в этом подподклассе "2" (3.1.3.2)

Наряду с шифром фермент имеет систематическое название, которое составляется в соответствии с определенными (для каждого из классов) правилами, оно по возможности точно определяет действие фермента и тем самым идентифицирует его.

16

Ферменты: структурная классификация

По типу общей структурной организации можно выделить несколько групп ферментов.

(1)Ферменты, образованные одной полипептидной цепью (лизоцим).

(2)Ферменты, образованные несколькими полипептидными цепями, соединенными дисульфидными мостиками (химотрипсин).

(3)Олигомерные ферменты, образованные несколькими идентичными (мышечная фосфорилаза) или различными (аспартаткарбамоилтрансфераза из E.coli) субъединицами, связанными нековалентными связями.

17

Ферменты: структурная классификация

(4)Полифункциональные ферментные ансамбли; в таком ансамбле одна полипептидная цепь образует активные центры нескольких функционально связанных ферментов (в клетках млекопитающих первые три фермента пути биосинтеза пиримидинов -- карбамоилфосфатсинтетаза, аспартат-карбамоилтрансфераза и дигидрооротаза образованы одной полипептидной цепью с молек. массой

2150 кДа).

(5)Полиферментные комплексы. В состав таких комплексов, образованных за счет нековалентных взаимодействий, входит несколько индивидуальных ферментов; обычно эти ферменты функционально взаимосвязаны и катализируют серию последовательных реакций, например, пируватдегидрогеназный комплекс E.coli включает три фермента: пируватдегидрогеназный компонент,

дигидролипоилтрансацетилазу и дигидролипоилдегидрогеназу.

18

Ферменты: кофакторы

По признаку зависимости активности от дополнительных небелковых компонентов, которые называются кофакторами, ферменты можно разделить на две группы. Представители одной группы не нуждаются в кофакторах (они состоят только из полипептидных цепей), для активности представителей другой группы кофакторы необходимы. В качестве кофакторов могут выступать ионы металлов, например, Fe2+, Zn2+, а также весьма сложные органические молекулы; последние называют коферментами. Некоторые ферменты содержат как кофермент, так и ионы металлов. В одних случаях кофермент прочно связан с белком, такой кофермент называют простетической группой. В других случаях кофермент образует с белком диссоциирующий комплекс; каталитически активный комплекс, содержащий диссоциирующий кофермент, называют холоферментом, а собственно белковую часть комплекса -- апоферментом.

Примерами коферментов, образующих диссоциирующие комплексы с апоферментами, являются пиридоксальфосфат, участвующий в различных превращениях аминокислот, а также переносчик водорода никотинамидадениндинуклеотид.

19

Ферменты: кофакторы

Примером двухкомпонентного фермента является пируватдекарбоксилаза, катализирующая расщепление пировиноградной кислоты на двуокись углерода и уксусный альдегид. Простетическая группа пируватдекарбоксилазы (тиаминнирофосфат) образована молекулой тиамина (витамина B1) и двумя остатками фосфорной кислоты. Простетические группы ряда важных окислительно-восстановительных ферментов -- дегидрогеназ содержат производное амида никотиновой кислоты (ниацина), или же рибофлавина (витамина B2); в состав простетических группы т. н. пиридоксалевых ферментов, катализирующих перенос аминогрупп (–NH2) и декарбоксилирование и ряд др. превращений аминокислот, входит пиридоксальфосфат – производное витамина B6; активная группа (КоА) фермента, катализирующих перенос остатков различных органических кислот (например, ацетила CH3CO–),

включает витамин пантотеновую кислоту.

20