Файл: Генетическая инженерия 16.09.14.pdf

1.Рестрикционные ферменты

1.В практической молекулярной биологии чаще всего используются рестриктазы II типа, сайт узнавания для которых в большинстве случаев представляет собой палиндром.

2.Палиндром Фета «А роза упала на лапу Азора».

3.Уникальные последовательности нуклеотидов, являющиеся субстратом

для рестриктаз, характеризуются большим разнообразием первичной

структуры.

4.Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК).

6. Несколько сотен эндонуклеаз выделены из бактерий и многие используются в исследовании ДНК и генной инженерии, такие как: EcoR1, Hind III, HaeIII, TaqA1, Sau3A

Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции

Расщепление фрагмента ДНК рестриктазой типа II Hind II с образованием тупых концов

ДНК-лигаза

“сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК

ЭТАПЫ СОЗДАНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ.

ВЕКТОРНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ

Генетическое конструирование in vitro

•Получение нужного гена (трансгена), намеченного для переноса

•Создание специальных генетических конструкций – векторов (переносчиков)

•Генетическая трансформация

•Молекулярная селекция

•Выращивание измененных клеток в целые трансгенные организмы

Получение генов

•выделением из ДНК любых организмов

•химико-ферментным синтезом

•ферментным синтезом

Выделение генов из ДНК

Проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар):

1.Расщепление можно проводить посередине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые тупые концы.

2.Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие.

Химико-ферментный синтез

Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно

8–16-звенных

Структура химически синтезированного Хораной функционально активного отрезка ДНК кишечной палочки

Цифры – нумерация нуклеотидов:

промотор от -52 до -1

ген супрессорной тирозиновой тРНК от 1 до 125

терминатор от 127 до 146

на концах отрезка тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА

Ферментный синтез гена на

основе выделенной матричной РНК (мРНК)

•Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить.

•Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратой транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная м РНК (кДНК)

•Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы.

•Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния

Синтез кДНК

Синтез кДНК. К препарату очищенной мРНК добавляют праймер oligo(dT). Для синтеза ДНК на РНК-матрице используют фермент обратную транскриптазу и четыре dNTP. In vitro обратная транскриптаза не обеспечивает синтез полноразмерных кДНКкопий на всех матрицах и образует на конце растущей цепи шпильку со свободной 3'-ОН-группой. Эта группа инициирует синтез второй цепи ДНК при участии фрагмента Клёнова. После завершения синтеза молекулы мРНК гидролизуют РНКазой, а ДНК обрабатывают нуклеазой S1, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек.

Схема ферментативного синтеза гена с помощью обратной транскрипции

Выделение фрагментов ДНК, содержащих нужный ген

Открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, — обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид.

Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся в клетке в виде нескольких копий. Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.

3. Вектор должен обладать следующими свойствами.

1.Способность к автономной (т.е. независимо от хромосомы реципиента) репликации в клетке реципиента.

2.Наличие сайта, в котором возможно встраивание желаемого фрагмента ДНК.

3.Наличие одного или нескольких маркерных генов, благодаря которым клетка-реципиент будет обладать новыми признаками, позволяющими отличить трансформированные клетки (т.е. содержащие рекДНК) от исходных.

4.Кроме того, чтобы чужеродный ген экспрессировался, необходимо его поместить под соответствующий промотор.

3. Вектора

•p ОБОЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИД, B и R по имени создателей Bolivar и Rodriguez

•Плазмида имеет двуспиральную (ds) ДНК - ds-DNA 4361 BP (пар оснований

•Содержит район репликации и селективные гены: ampR и tetR , устойчивости к антибиотикам

•Имеет уникальные сайты рестрикции Pst I, EcoR I, Hind III, Sal I и Cla I

•Число копия на клетку высоко (20 – 30)

•Может нести вставку ДНК величиной 1-5kb