Файл: Генетическая инженерия 16.09.14.pdf

Практические методы генетической трансформации растений

Посредством Agrobacterium tumefaciens

Прямой ввод генов методом биобаллистики

Методы микроинъекций, электропорации протопластов не имеют практического значения, кроме как для нескольких генотипов риса.

Требования к системам генетической

трансформации (СГТ)

Трансформационное событие сопровождается рядом негативных для селекционера процессов:

•Инсерционным мутагенезом, вследствие случайности сайта интеграции ДНК

•Феноменом «умолкания генов» (gene silencing phenomenon)

•Трансгенные растения показывают различную степень экспрессии трансгенов вследствие эффекта положения, количества встроенных копий и etc.

Правила биобезопастености, принятые в Евросоюзе не рекомендуют использовать гены

устойчивости к антибиотикам в качестве селективных

•Необходима позитивная селекция на основе гена фосфоманозаизомеразы (PMI) или гербицид устойчивости – bar или:

•Необходимо использование « Систем удаления селективного гена посредством

индукции рекомбинации»

Для получения достаточной выборки трансгенных растений, фенотипические не отличающихся от исходных (только по

вводимому гену) СГТ должна обладать:

•Высокой эффективностью;

•Воспроизводимостью;

•Для уменьшения риска сомаклональной изменчивости уменьшением фазы культуры in vitro

Разработка «генной пушки» под руководством Джона Сандфорда и Теодора Клейна в Корнельском Университете, США (1983 – 1987)

Права на технологию были проданы Du Pont в 1990 г.

Source: [(2000) In Vitro, Cell Dev Biol Plant 36:303–308; Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987), J Part Sci Technol 5:27–37]

Источник давления

«Макроноситель»

Металлические частицы с ДНК

Клетки растений

Генетическая трансформация растительных клеток путем Биологической баллистики (Biolistic)

Баллистической способ генетической трансформации, связанный с преципитацией ДНК на микроскопические частицы и последующим обстрелом этими частицами клеток живой ткани, были впервые применены на растениях в 1987, в 1990 году первые фертильные растения трансгенной кукурузы были получены с помощью этого метода.

Эта демонстрация была важным поворотным пунктом в области генной модификации зерновых культур, как и демонстрация в 1983 году способности трансформировать растения

Agrobacterium tumefaciens

Klein T.M., Wolf E.D , Wu R. and Sanford J.C. (1987) High-velocity microprojec-tiles for delivering nucleic-acids into living cells. Nature 327 , 70 – 73 .

Gordonkamm W.J., Spencer T.M., Mangano M.L., Adams T.R., Daines R.J., Start W.G. Obrien J.V., Chambers S.A., Adams W. R., Willetts N.G., Rice T.B., Mackey

C.J., Krueger R W., Kausch A.P. And Lemaux , P. G. (1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2, 603 – 618 .

Общая схема установки PDS 1000 SYSTEM Bio Rad

PDS 1000 He SYSTEM Bio Rad

Прибор компании Bio Rad для генетической трансформации клеток растений in vivo методом биологической баллистики

История баллистической трансформации

растений

Доктор Кристофера Сауттер, Цюрих, Федеральный Институт Технологии, 1991 год.

Генная пушка PIG (Particle Inflow Gun), конструкции Д.Файнера и др.

Сотрудники лаборатории проф. Д.Файнера (1993 г.)

Вустер, Огайо, США

L-R Back: John Finer, Tai-Sheng Cheng, Masood Hadi, Hong-Chang Ma Front: Cheri Nemes, Alex Gaponenko, Philippe Vain, Barb Norris

PIG в секторе клеточной инженерии растений института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН

Основные этапы генетической трансформации и получения

генетически модифицированного (генно-инженерного или биотехнологического) растения

1.Индукция морфогенного каллуса или прямой регенерации клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro.

2.Создание векторных конструкций для доставки и регуляции экспрессии генов

«интереса» в клетку-мишень, компетентную к регенерации в растение.

3.Встраивание чужеродных генов в геном реципиента – посредством агробактериальной трансформации или прямого ввода генов via биобаллистики.

4. Селективный отбор трансформированных клеток. Введение наряду с геном

«интереса» селективного гена для негативной - (устойчивость к антибиотикам

– гены hyg, nptII) или позитивной селекции – (способность усваивать продукт – ген PMI фосфоманозаизомераза).

5.Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro.

6.Укоренение или прививка побегов.

7.Адаптация пробирочных растений к условиям теплицы.

8.Молекулярный – ПСР и саузерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена.

9.Отбор трансформантов с высокой экспрессией трансгена и с наименьшими отклонениями от исходного фенотипа.

10.UPOF – полевые испытания и испытания на биобезопасность.

Индукция морфогенного каллуса, выбор экспланта

или клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro.

Bombardment

Селективный отбор трансформированных клеток, на среде с селективным агентом

Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro.

Укоренение или прививка побегов

Молекулярный – ПСР, RT-PCR и Cаузерн, Вестерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена.

Нами исследованы параметры баллистической трансформации, влияющие на эффективность трансформации

Физические параметры

Физические и химические свойства металлических частиц используемых для переноса ДНК (размер, хим. инертность)

Природа ДНК (концентрация, размер молекул), преципитация ДНК на частицы

Давление и обьем Не при выстреле

Величина отрицательного давления вакуума в камере

Расстояние от источника частиц до ткани-мишени

Количество выстрелов на один образец ткани

Биологические параметры

Выбор типа и возраста экспланта

Обработка ткани-мишени осмотическим шоком до и после бомбардмента

Стратегия селекции трансгенных тканей

Отложенная

Градационная

Регенерационная