Файл: Генетическая инженерия 16.09.14.pdf

Бинарные векторы CAMBIA

Маркерный ген

Селективный ген

Селективный ген

Обязательными элементами бинарного вектора являются:

• Сайт инициации репликации широкого круга хозяев, либо два репликатора, функционирующих в E. Coli

иA.tumafaciens;

•Правую и левую фланкирующую последовательность Т-ДНК;

•Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания/инсерции гена (генов) между границами Т-ДНК;

•Ген, обеспечивающий селекцию трансформантов бактерий, содержащих данный вектор;

•Целевую кодирующую последовательность, для переноса в растения.

Маркерные гены, для отслеживания процессов трансформации и экспрессии в трансгенных клетках, тканях и растениях

Маркерные гены: ген люцефиразы luc

Маркерные гены β-глюкоронидаза - uidA

A B

Мониторинг транзиентной экспрессии гена

β-глюкоронидазы uidA, при биобаллистической трансформации

подсолнечника: A – незрелых зародышах, B – семядолях подсолнечника.

(Гапоненко, 1993 )

Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в трансгенном подсолнечнике:

A – разрез незрелого соцветия; B – цветках и развивающихся семенах;

C – прорастающих семенах T1 (2ой генерации) и D – различных тканях растения.

A B

D C

(Гапоненко, 1997 )

Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в трансгенном

подсолнечнике: A – разрез незрелого соцветия;

B – специфическая экспрессия гена uidA в пыльцевых нитях.

A B

(Гапоненко, 1997)

Маркерные гены: Green Fluorescent Protein - GFP

Мониторинг транзиентной экспрессии гена gfp в незрелых зародышах и каллусных тканях пшеницы после биобаллистики

(а) Транзиентная экспрессия гена gfp в незрелом зародыше пшеницы

(б, в) Транзиентная экспрессия гена gfp в каллусных тканях через 24 часа после биобаллистической трансформации; (г) контроль не трансформированный каллус (Фадеев, Гапоненко, 2006)

Оценка стабильной экспрессии гена gfp

Стабильная экспрессия gfp гена в трансгенных тканях пшеницы

Экспрессия маркерного гена gfp, обнаруживаемая на 17 день после биобаллистической трансформации, определяется как стабильная

(Фадеев, Гапоненко, 2006)

Типы селекции (отбора) трансформированных клеток растений

Позитивная Негативная

При позитивной селекции селективные гены способствуют росту

трансформированных тканей, а при негативной селекции селективные гены ведут к смерти или торможение роста нетрансформированных клеток и тканей.

Гены кодирующие токсичные антибиотики для негативной

селекции

Вещества и ферменты для углеводород зависимой позитивной селекции

Токсичные гербициды, гены их кодирующие для условно-позитивной селекции

Генетическая трансформация злаков via Agrobacterium tumefaciens

ИСТОЧНИК:

Plant Biotechnology Journal

(2006), 4, pp. 575–603 Ashok Kumar Shrawat and Horst Lцrz

Agrobacterium-mediated transformation of cereals: a promising approach crossing barriers

Трансформация пшеницы via Agrobacterium с селекцией на глифосате

Agrobacterium-mediated large-scale transformation of wheat (Triticum aestivum L.) using glyphosate selection,

Plant Cell Rep (2003) 21:1010–1019, T. Hu, S. Metz, C. Chay, H. P. Zhou, N. Biest ·G, Chen, M. Cheng, X. Feng, M. Radionenko, F. Lu,·J. Fry

a Four-day precultured immature embryo

b Agrobacterium infection, c embryogenic callus after 1 week mM glyphosate selection medium,

d shoot differentiation C+0.1 mM glyphosate e plantlet regeneration +0.02 mM glyphosate

f T0 transgenic plant (left) and non-transgenic control (right) 7 days after being sprayed with Roundup Ultra; this kind of transgenic event (left) with some vegetative damage will not be advanced to the next generation

Проф

Что еще необходимо нам рассмотреть по теме:

1.Компетентные к регенерации в растения клетки или ткани

2.Другие способы доставки генов в клетки, компетентные к регенерации в растения

3.Векторные конструкции для доставки генов, представляющих интерес

4.Селективные и маркерные гены

5.Способы регуляции экспрессии целевого гена в нужном месте и в нужное время.

6.Возможность «выключать» собственные гены растения и/или патогенного организма, насекомого вредителя.

7.Стабильность интеграции и наследования введенных генов

ДЛЯ УСПЕШНОГО ПРОИЗВОДСТВА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ НЕОБХОДИМА ТРЕХКОМПОНЕНТАЯ СИСТЕМА:

ИНТЕГРАЦИЯ СИСТЕМЫ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, СИСТЕМА ДОСТАВКИ ДНК, И ВЕКТОРА, НЕСУЩЕГО ГЕН ИНТЕРЕСА

69

69

Схематическое

представление физических и биологических методов, используемых для переноса генов в растения

70