ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 17.07.2019
Просмотров: 586
Скачиваний: 1
З метою зберігання чистоти унікальних виробничих і еталонних штамів мікроорганізмів і запобігання їх контамінації проводять пасажування штамів з дотриманням стерильності в умовах боксу. Одночасно в одному боксі можна пасажувати не більше одного штаму збудника хвороби. Кількість пасажів тестового мікроорганізму на поживних середовищах: з моменту його відновлення до моменту його цільового використання за можливості повинна бути мінімальною. Запаси еталонної культури не повинні поповнюватися за рахунок культури тимчасового зберігання. Контроль еталонного штаму на чистоту і відсутність дисоціації необхідно проводити перед закладанням на тривале зберігання і перед поповненням запасів культури тимчасового зберігання. Для цільового використання придатні культури еталонного штаму, що пройшли з моменту висіву із культури тимчасового зберігання не більше 5 пасажів.
Культура еталонного штаму, що пройшла не більше 5 пасажів після висіву з культури тимчасового зберігання та призначена для використання називається культура цільового використання.
З метою контролю зберігання властивостей штамами мікроорганізмів у музеях проводять періодичну перевірку їх відповідності паспортним даним.
Паспорт штаму – мікроорганізму (вірусу) – офіційний документ, що містить повну назву штаму, відомості про походження, коротку характеристику морфологічних, біохімічних та культуральних властивостей штаму, призначення тест-штаму, умови підтримування та культивування.
Відомості про всі штами мікроорганізмів, які надійшли в музеї та їх рух підлягають реєстрації в спеціально прошнурованих і пронумерованих книгах, скріплених печаткою і підписом керівника установи.
З цією метою у лабораторіях, що зберігають штами мікроорганізмів необхідно вести такі документи: журнал обліку надходження штамів мікроорганізмів; інвентарна книга виробничих і контрольних штамів мікроорганізмів; журнал обліку руху виробничих або контрольних штамів; книга обліку зараження тварин; книга обліку виділених культур і їх знищення; книга записів результатів перевірки властивостей виробничих або музейних штамів вірусів, бактерій, грибів, токсинів і отрут тваринного походження; паспорт.
СЕЛЕКЦІЯ ШТАМІВ ДЛЯ СТВОРЕННЯ СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ ТА ВАКЦИННИХ ШТАМІВ.
Шляхом простого підбору отримати високоактивні продуценти не вдається, тому стратегія селекційної роботи з мікроорганізмами полягає у пошуку природних форм, які володіють корисними якостями для людини (синтез цінної сполуки, висока швидкість росту, здатність до засвоєння дешевих та доступних матеріалів) та створенню на їх базі промислових штамів. Це відбувається шляхом зміни регуляції метаболічної активності мікробної клітини.
Методи сучасної селекції – це сукупність маніпуляцій, за допомогою яких змінюють генетичну програму мікроорганізмів.
Генетичне конструювання in vivo – отримання та виділення мутантів з використанням різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин.
Генетичне конструювання in vitro базується на використанні генетичної інженерії (створення рекомбінантних ДНК). Проте, цей поділ умовний, тому що методи взаємопов‘язані.
Клон - (від грец. klon – гілка нащадків) – популяція клітин або організмів, що походять від загального предка шляхом безстатевого розмноження.
Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тест-культури мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). За необхідністю вирощують кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність синтезованої речовини.
Метод індикаторних чашок полягає у вирощуванні окремих колоній у чашках з середовищем з індикатором, якій виявляє різницю рН між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти різняться за коліром колоній та фенотипом (на агарі з трифенілтетразолієм колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів утворюються прозорі зони.
Метод тест-культур вимагає використання ауксотрофів та чутливих до антибіотиків культур. Характеристику мутантів проводять за зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю колоній. Отримання та вдосконалення штамів-продуцентів амінокислот вимагає перевірки великої кількості мутантів. Ефективність селекції тим вища, чим більший об‘єм матеріалу, що піддається відбору. Між тим під час «відбору у ручну», коли виділяються окремі колонії та перевіряються в умовах ферментації в колбах на гойдалках, вірогідність находження високоактивних штамів обмежується кількістю матеріалу. Тому попередня оцінка активності штамів-продуцентів амінокислот дозволяє виключити заздалегідь безперспективні мутанти, і відповідно, скоротити кількість варіантів, що потребують кінцевої перевірки
Принцип дії методу тест-культур базується на явищі синтрофізму, коли під час сумісного висіву на мінімальне поживне середовище навколо колоній продуцентів утворюються зони росту мікробів, які потребують відповідні амінокислоти. Розмір зон знаходиться у прямій залежності від кількості амінокислоти, що синтезується. Колонії, що утворюють найбільші зони, використовують для подальших перевірок за допомогою більш складних та точних способів оцінки - ферментацією у колбах та ферментерах. Для використання цього методу у селекції штамів- продуцентів амінокислот необхідною умовою є наявність відповідних тест-культур, ауксотроф них за певними амінокислотами.
Метод відбитків, запропонований Ледерберг Д, Ледерберг Е, 1952р.
Сутність методу полягає у відборі мутантів, що здатні рости на різних середовищах:
1. Чашки Петрі із звичайним середовищем засівають культурою мікроорганізму, таким чином щоб на ній виросло 50-200 колоній.
2. Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на металевий циліндр з діаметром, що відповідає чашці Петрі, та закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.
3. Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладають чисті чашки з різними середовищами.
4. Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних факторів (температура, фаги, антибіотики).
Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.
Досягнення молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв‘язку кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі метаболіту, або репресує синтез цього ферменту.
Мутант ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування речовини, яка є продуктом блокованої реакції.
ВИМОГИ ДО ОСНОВНИХ ВИДІВ СУБСТРАТІВ.
Культивування є важливою стадією збереження, підтримування, напрацювання біомаси та синтезу цінних метаболітів штамами – продуцентами.
Культивування(ферментація)- це сукупність послідовних операцій, від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.
Будь-який біотехнологічний об‘єкт потребує поживного середовища, до складу якого входить субстрат, який є джерелом вуглецю та енергії, забезпечує нормальний розвиток та біосинтетичну активність об’єкта.
Будь-яке поживне середовище повинно відповідати наступним вимогам:
містити усі необхідні для росту та розмноження мікроорганізму речовини;
мати достатню вологість;
відповідне рН, Еh;
усі середовища повинні бути максимально уніфікованими.
За складом середовища поділяють на:
культуральне середовище з хімічно визначеним складом – так зване синтетичне поживне середовище, що складається з хімічно визначених інгредієнтів (з відомою молекулярною структурою та ступенем чистоти);
культуральне середовище з неповністю охарактеризованим хімічним складом – середовище, що складається повністю або частково з природних матеріалів, оброблених або незмінних, хімічний склад яких визначений неповністю (з природних продуктів тваринного та рослинного походження, з різних екстрактів, бульйонів та відварів з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин).
Мікроорганізми, що нездатні синтезувати усі органічні сполуки, необхідні для їх росту та розмноження (вітаміни, амінокислоти, 22 нуклеотиди) називаються ауксотрофними та потребують внесення у середовище факторів росту
За консистенцією середовища бувають:
рідкі – для вивчення фізіолого-біохімічних властивостей штамів-мікроорганізмів, для накопичення біомаси та продуктів біосинтезу;
напіврідкі – для тривалого збереження штамів-мікроорганізмів;
щільні – для виділення чистих культур, вивчення морфології колоній, кількісного обліку, визначення антагоністичних властивостей, селекційного відбору;
сипучі середовища – використовують для зберігання посівного матеріалу культур продуцентів. До них відносять розварене пшоно, активоване вугілля, кварцовий пісок, просочений поживним розчином.
За призначенням середовища поділяють на:
звичайні – для культивування більшості мікроорганізмів (як приклад, МПА, МПБ);
спеціальні – для виділення та культивування певних груп та видів штамів- мікроорганізмів;
елективне – селективне середовище збагачення, що підтримує розмноження певних видів мікроорганізмів, частково або повністю пригнічуючи ріст інших мікроорганізмів (для виділення певного виду з місць його природного накопичення). (наприклад, середовище Раппапорта- Василиадиса (Rappaport-Vassiliadis).
диференційно-діагностичні – для вивчення біохімічних властивостей та для диференціації штамів за ферментативною активністю.
Також за призначенням середовища розрізняють:
Середовища для транспортування – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів з моменту їх відбору до початку аналізу у лабораторії. Такі середовища, як правило містять такі речовини, що не допускають розмноження мікроорганізмів, але гарантують їх збереження (наприклад, транспортне середовище Стюарта або Еймса).
Середовища для збереження мікроорганізмів – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів протягом тривалого періоду, щоб захистити їх від несприятливих факторів та дозволити відновити ріст мікроорганізму після цього періоду (наприклад, яєчне середовище Дорсе);
Середовище для відновлення – культуральне середовище, що дозволяє мікроорганізмам, які знаходяться у стані стресу або ослаблення, відновлювати здатність до нормального росту без обов‘язкових умов до їх розмноження.
Середовище збагачення – культуральне середовище, що забезпечує особливо сприйнятливі умови для розмноження мікроорганізмів.
Культуральні середовища, що мають багатоцільове використання – культуральні середовища, що можуть відноситися до деяких категорій одночасно, наприклад кров‘яний агар є середовищем відновлення, виділення та диференційним, для визначення гемолізу.
ОСНОВИ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. До складу поживних середовищ входять різні компоненти: пептон (джерело азоту), вуглеводи (джерело вуглецю), мінеральні речовини (неорганічні солі), селективні речовини, вітаміни, фарбники та індикатори рН, гелеутворюючі компоненти.
-
Пептони (м’ясний, казеїновий, соєвий, желатиновий, дріжджовий та ін.) - продукти гідролізу білка, що являють собою суміш поліпептидів, олігопептидів, амінокислот, органічних джерел азоту, солей та мікроелементів. Характеристика пептону залежить від джерела білка та типу гідролізу (кислотного чи ферментативного). Гідролізати з високим ступенем розщеплення білка використовують для вирощування найбільш вимогливих до поживних середовищ мікроорганізмів. Гідролізати з низьким ступенем розщеплення використовують для вирощування більшості патогенних бактерій та для культивування вакцинних штамів.
Гідролізати крові краще використовувати для культивування гемофільних мікроорганізмів, а гідролізати молока – для молочнокислих бактерій.
Для контролю пептонів використовують наступні тести:
Ступінь перетравлювання;
Вміст азоту;
Втрати при 100оС;
Вміст амінного азоту;
Зольність;
Відсутність нітритів;
Вміст солей (NaCl);
Вміст фосфатів;
Мікроелементи;
Вуглеводи, що ферментуються;
Ліпіди;
Вітаміни;
Сумісність з іншими інгредієнтами при 121 оС - 15 хв.;
Культуральні та біохімічні властивості тест-культур (утворення індолу, сірководню, ацетилметилкарбінолу).
-
Вуглеводи. До складу поживних середовищ здебільшого входять наступні вуглеводи: адоніт, інулін, саліцин, арабіноза, крохмаль, сахароза, галактоза, ксілоза, сорбіт, глікоген, лактоза, трегалоза, гліцерин, мальтоза, фруктоза, глюкоза, манніт, целлобіоза, декстрин, манноза, еритрит, дульцит, рамноза, ескулін, інозит, раффіноза.
Вуглеводи, що використовуються у поживних середовищах, перевіряють на відсутність домішок. Контроль істинності вуглеводу перевіряють, готуючи рідкі та щільні поживні середовища з відомим вуглеводом – стандартним та тим, що досліджується. Перевіряють здатність вуглеводів підтримувати ріст мікроорганізмів. На щільних середовищах після культивування порівнюють характеристики колоній на стандартному середовищі та тому, що досліджується.
3. Мінеральні речовини. Мінеральні солі необхідні для росту та метаболізму усіх живих клітин. Для більшості бактерій необхідно наявність у поживному середовищі Na, K, Mg, Fe2+, 3+.
4. Селективні речовини (солі жовчних кислот та бичача жовч). Речовини, що отримують з жовчі, вводять до складу поживних середовищ для диференціації бактерій, адаптованих та неадаптованих до умов кишечнику. Для диференціації бактерій за толерантністю до жовчі готують селективні середовища з підвищеною концентрацією жовчі та її похідних. У середовищі ці речовини не повинні впливати на первинний колір індикатора та його подальші зміни у процесі росту мікроорганізмів. Щільні поживні середовища з різними солями жовчі перевіряються методом поверхневої краплі за Miles та Misra.