5. Фарбники та індикатори. Фарбники, що додаються у середовища використовують як селективні речовини, а також як індикатори рН та окисно-відновного потенціалу. Їх інгібуючи активність залежить від взаємодії з іншими компонентами середовища. Так, активність бріліантового зеленого по відношенню до E. coli суттєво варіює у розчинах різних пептонів. З бріліантовим зеленим взаємодіють солі жовчі, в результаті чого знижується токсичність фарби, що необхідно враховувати під час конструювання середовищ. Анілінові фарбники більш токсичні у стані повного окислення, а під час їх стерилізації у присутності пептону можливе їх часткове відновлення. Також під час використання агару з високим вмістом мінеральних речовин часто спостерігається несумісність компонентів середовища. Окрім контролю хімічної чистоти фарбник повинен бути перевірений мікробіологічним методом, шляхом висіву референт-штаму у середовище зі стандартним та досліджуваним фарбником.

Індикатори вводять у поживні середовища для визначення змін рН середовищ під час росту мікроорганізмів та контролі Еh. Наприклад, феноловий червоний у діапазоні рН 6,8-8,4 змінює колір середовища від жовтого до червоного, бромтимоловий синій у діапазоні рН 6,0-7,6 з жовтого на синій, а фенолфталеїн у діапазоні рН 8,3-10,0 з безкольорового на червоний.

6. Гелеутворювачі. Для конструювання щільних середовищ у якості ущільнювача використовують агар, продукт екстракції червоних та бурих водоростей. Основний компонент агару – кальцієва сіль ефіру сірчаної кислоти та поліцукру агарози. Більшість мікроорганізмів не розщеплює агар – він є інертним компонентом поживного середовища.

КОНСТРУЮВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

Для культивування мікроорганізмів на даний час використовують «нестандартні поживні середовища», які необхідно контролювати за вмістом загального та амінного азоту та рН.

Для конструювання поживних середовищ необхідно дотримуватися наступних принципів:

 задоволення поживних потреб мікроорганізмів;

 вибір джерел сировини для конструювання середовищ;

 диференціація поживних середовищ за цільовим призначенням;

 оптимізація поживних середовищ;

 стандартизація поживних середовищ.

Якість поживного середовища контролюють за такими параметрами:

 колір;

 запах;

 вологість;

 розчинність;

 прозорість;

 гелеутворення;

 температура плавлення;

 рН;

 еH;

 ростові якості середовища визначають для відповідних типових культур тест- мікроорганізмів за показниками:

 швидкість росту;

 чутливість;

 кількість біомаси;

 які мікроорганізми ростуть на середовищі;

 мікроорганізми, ріст яких пригнічується;

 характеристика колоній на середовищі;

 стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів.

Швидкість росту визначається кривою росту та дозволяє оцінити стандартність середовищ та їх компонентів й характеризує середовища як:

---

 середовище з коротким лаг-періодом для швидкого росту невеликої висхідної кількості клітин (для визначення стерильності, для отримання посівного матеріалу для ферментації і ін.);

 середовище, що забезпечує максимальну кількість клітин, може бути використана для отримання біомаси під час виготовлення вакцин.

Чутливість визначається за мінімальним числом колонієутворюючих одиниц (КУО) під час посіву мікробної завісі заданої концентрації, при якому спостерігається ріст на усіх засіяних чашках.

Стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів оцінюють шляхом вивчення характерних для певного виду морфологічних та фізіологічних ознак під час росту на середовищі, яке контролюється.

Культивування м.о розпочинається з лаг-фази, під час якої клітини адаптуються до певних умов.

Експоненціальна фаза(фаза логарифмічного росту)- характеризується інтенсивними діленням мікробних клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною.

В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється й культура переходить у стаціонарну фазу.

Фаза старіння та відмирання мікробної культури характеризується закінченням енергетичних запасів культуральної рідини та припиненням клітинного метаболізму. Процес культивування(ферментації) потрібно зупинити до настання цієї фази.

МЕТОДИ ПРИГОТУВАННЯ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ У БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ПРОЦЕСАХ.

ПРАВИЛА РОБОТИ З СУХИМИ ПОЖИВНИМИ СЕРЕДОВИЩАМИ

 До роботи допускається персонал, якій ознайомлений з технікою безпеки під час роботи з сухими середовищами.

 Більшість поживних середовищ у сухому вигляді являють собою дрібнодисперсні литки порошки, тому слід уникати їх вдихання, особливо глибокого. Потрапляння таких порошків може викликати подразнення верхніх дихальних шляхів або, навіть, пневмонію. Тому, слід уникати надмірного розпорошення порошку, або працювати у масках та респіраторах. При потраплянні порошку у ротову порожнину, останню промити, після чого випити 2 склянки води. У разі вдихання - звернутися за медичною допомогою.

 Деякі поживні середовища мають у своєму складі токсичні речовини (натрія азид, циклогексимід, літія хлорид, фуксин основний, натрія гідроселенит та ін..), тому слід уникати тривалого контакту порошку середовищ зі шкірою, або працювати у рукавичках. З токсичними речовинами необхідно працювати чітко дотримуючись інструкції.

 Не використовувати середовище після закінчення терміну збереження

 Герметично закривати упаковки з залишком середовища.

ВИМОГИ ДО ЗБЕРЕЖЕННЯ СУХИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

Сухі поживні середовища випускають у вигляді порошків, гранул та таблеток, вони гігроскопічні, чутливі до дії вологи, температури, світла та перепадів температури. Тому, зберігати середовища необхідно в умовах, що рекомендує виробник та не використовувати після закінчення строку їх збереження. Сонячне світло негативно впливає на середовища, тому останні зберігають у темноті (шафи). У зв‘язку з високою гігроскопічністю сухі поживні середовища псуються від надлишку вологи, тому тара у якій вони зберігається повинна бути герметичною. Сухі поживні середовища, як правило, мають термін збереження в оптимальних умовах не більше 2-5 30 років. Невідкриті флакони з середовищами слід зберігати при температурі нижче 25 оС.

---

ПРАВИЛА ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ

1. Дотримуватися належної лабораторної практики та інструкцій виробників під час роботи з сухими поживними середовищами.

2. Перед приготуванням середовища перевірити повну ідентичність усіх компонентів (код та номір партії).

3. Вода. Для розчинення середовища використовувати дистильовану або деіонізовану воду з рН не нижче 5,5. Якщо рН нижче рекомендується воду прогріти для видалення залишків СО2. Дистильовану воду слід зберігати у контейнерах, виготовлених з інертних матеріалів (скло, поліетилен), що не інгибують ріст мікроорганізмів. УВАГА! Вода, що пройшла через іонообмінні пристрої (деіонізована), може бути обсіменена мікроорганізмами.

4. Зважування. Зважують дотримуючись інструкції до лабораторних вагів та заходів безпеки під час зважування.

5. Розчинення та дисперсія. Сухі середовища потребують швидкої дисперсії шляхом постійного перемішування з підігрівом. Середовищам, що містять агар, необхідно декілька хвилин для всмоктування води з перемішуванням до підігріву. Для середовищ, що готуються з окремих компонентів, останні додаються окремо, повністю розчиненими. Для розчинення сухого середовища у посуд наливають половину потрібної води, потім наважку середовища, ретельно розмішують та вносять усю воду. Порошок на стінках сосуду повинен бути змитий. Забезпечити ретельне перемішування середовища можна скляною паличкою або колбою, об‘ємом у двічі більшим за кількість середовища.

6. Вимірювання рН. Для визначення рН середовища використовують рН-метр (індикаторні смуги не використовують). Після стерилізації та охолодження середовища, або окремих його компонентів, до температури 25 °С, рН-метрію проводять згідно інструкції. Як правило, рН середовища після стерилізації зміщується, тому необхідне значення останнього отримують додаючи, по краплях, NaOH, концентрацією приблизно 40 г/л (1 мол/л) або соляною кислотою (HCl) приблизно 36,5 г/л (1 мол/л) .

7. Розливання. Середовище розливають у скляні пляшки об‘ємом у 2-3 рази більшим ніж об‘єм середовища. Усі пляшки з середовищем обов‘язково маркують (підписують водостійким маркером назву та дату виготовлення середовища).

8. Стерилізація. Середовища стерилізуються залежно від складу в умовах автоклаву, кип‘ятінням або фільтрацією.

Зберігання готових поживних середовищ. Найкраще використовувати свіжовиготовлені середовища. Проте, за необхідністю більш тривалого збереження, середовища у пляшках можуть зберігатися у захищеному від світла та прохолодному (12-16°С) місті до 6 місяців. Строк збереження готових поживних середовищ залежить від їх складу.

Середовища заборонено заморожувати!

МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ В БІОТЕХНОЛОГІЇ ОТРИМАННЯ ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

Важливим елементом у процесі виготовлення кінцевого імунобіологічного препарату є стерилізація – знищення усіх форм життя (зокрема, живих мікроорганізмів) у стані вегетації та спокою. Стерилізації обов‘язково піддають усі матеріали, захисний одяг, інструменти, посуд, поживні середовища, пакувальні матеріали, що використовуються у процесі виготовлення стерильних імунобіологічних препаратів. Усі потоки можуть стерилізуватися термічним, радіаційним, хімічним, фільтраційним та комбінованими методами. Дія усіх стерилізуючих агентів базується на інактивації внутрішньоклітинних речовин, необхідних для росту та репродукції клітин.

---

Стерилізація радіацією. Радіаційна стерилізація використовується, головним чином, для стерилізації матеріалів і продукції, що чутливі до нагрівання. Багато лікарських засобів і деякі пакувальні матеріали чутливі до радіації, отже цей метод припустимий лише у випадку відсутності шкідливого впливу на продукцію. Тому цей метод використовують для стерилізації невеликих об’єктів (хірургічний інструмент, перев’язочний матеріал). Під час процесу стерилізації слід вимірювати дозу випромінювання. Для цих цілей слід використовувати дозиметри, показання яких не залежать від інтенсивності випромінювання, але забезпечують кількісну реєстрацію дози випромінювання, поглиненою стерилізованою продукцією.

Хімічний метод стерилізації базується на використанні речовин, які володіють дезінфікуючими властивостями. Основна проблема цього методу полягає у видаленні стерилізуючого агенту з поживного середовища. Це досягається шляхом розкладення агентів з утворенням нетоксичних для виробничої культури продуктів.

Термічний метод. Найбільш часто у технологічному процесі виготовлення стерильних імунобіологічних препаратів використовують термічний метод стерилізації. Він базується на згубному впливі на живі клітини високих температур. Стерилізація досягається фламбуванням (обробкою відкритим полум‘ям), сухим гарячим повітрям, кип‘ятінням та насиченою парою. Для стерилізації посуду, матеріалів, одягу, інструментів, поживних середовищ та розчинів найкраще зарекомендував себе метод обробки парою під тиском за допомогою автоклавів.

Конструктивно автоклави бувають декількох видів: що обертаються, гойдаються, горизонтальні, вертикальні та у вигляді колони. Проте, обов‘язковою умовою ефективної стерилізації є одночасне поєднання температури, тиску, часу та водяної пари. Основою будь якого стерилізатора є герметична камера, у якій відбувається процес стерилізації та парогенератор.

Згідно європейського стандарту prEN 13060/1-4 автоклави поділяються на три класи:

Автоклави класу «В» - мають функцію попередньої вакуумізації та функцію вакуумного висушування, можуть стерилізувати будь-які форми медичних виробів та тканин: великі, порожнисті, запаковані у пакувальні матеріали будь якого типу (інструменти, білизна, одяг, посуд).

Автоклави класу «S" – призначені для стерилізації гладеньких або порожнинних інструментів в упакуванні або без упакування.

Автоклави класу "N" – призначені для стерилізації металевих інструментів безпосередньо у лотку та не запакованих тканинних матеріалів без порожнин та щілин.

Найчастіше стерилізуються автоклавуванням поживні середовища.

Стерилізація поживних середовищ парою використовується у двох режимах: cтатичному в умовах автоклаву та стерилізація з перемішуванням.

---

Режими стерилізації поживних середовищ залежать від складу останніх (таб.3). Час нагріву стерилізаційної камери автоклаву (від 20 до 121 оС) залежить від конструкції останнього та контролюється манометром.

Час досягнення необхідної температури у масі поживного середовища залежить від об‘єму контейнеру та щільності завантаження автоклаву.

Якість стерилізації перевіряється використанням термо- та біоіндикаторів. Перші, у вигляді смужок, наклеюються на пакувальний папір і реагують на температуру у середині камери зміною кольору (таб.4). Їх використовують для контролю автоклавування посуду та інструментів.

ФІЛЬТРАЦІЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ, ЯКІ НЕ МОЖУТЬ БУТИ ПРОСТЕРИЛІЗОВАНІ У КІНЦЕВІЙ ПЕРВІСНІЙ УПАКОВЦІ

Стерилізуюча фільтрація – це процес проходження потоку через фільтровальний матеріал, під час якого відбувається затримка організмів.ю в результаті чого поток рідини звільняється від забруднення.

Стерильний продукт – продукт, що не містить життєздатних мікроорганізмів, в тому числі патогенних.

Стерилізуюча фільтрація використовується лише для газів та рідин.

Стерилізація фільтрацією може бути виконана у вакуумних або герметичних умовах. Розрізняють гідрофільні, гідрофобні, багаторазового використання та одноразового (шприцеві) фільтри.

Принципи проведення стерилізуючої фільтрації.

 Система має бути максимально простою.

 Розміри системи повинні забезпечувати обмеження потоку пре фільтром перед стерилізуючою фільтрацією.

 Стерилізуючий фільтр повинен бути вмонтований у кінцеву точку системи.

 Краще використовувати тиск (не вакуум).

 Усі клапани поміщати перед фільтром.

 Не використовувати сполучень з різьбою.

 Проводити тест на цілісність системи до та після фільтрації.

 Промивати обладнання зразу після використання.

 Проводити фільтрацію у максимально чистих умовах..

 Стерилізуючи фільтри стерилізуються шляхом автоклавуванням у розібраному або повністю складеному стані на протязі 15 хвилин при 121 °С. Якщо необхідно, після автоклавування фільтр збирають в стерильних умовах ламінарного боксу.

УМОВИ КУЛЬТИВУВАННЯ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ

Культивування є основною стадією технологічного процесу мікробного синтезу. Воно визначає кількісні та якісні характеристики виробництва біопрепаратів.

Під час культивування отримують біомасу та продукти метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у культуральній рідині.

Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.

Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.

---

Смотрите также файлы

• Індивідуальна робота №6.docx

• Індивідуальна робота №7.docx

• Індивідуальне завдання №8 (2).docx

• Індивідуальне завдання №8.docx

• Індивідуальне завдання №9.docx