Файл: Биотехнология 1 мод.docx

Генетичне конструювання in vitro базується на використанні генетичної інженерії (рекомбінантні ДНК). Поділ умовний, тому що вони взаємопов’язані.

Мутагенез та методи виділення мутантів.

Фундамент для сучасної селекції складає методи виділення клонованих культур.

Клон – це генетично однорідні нащадки однієї клітини (колонія, яка виросла з однієї клітини при посіві на тверде середовище)

Варіант – нащадки клона, які зявляються в результаті мінливості при наступних пересівах клонової культури

Штам - клонова за походженням культура, спадкова однорідність якої підтримується відбором за специфічними ознаками

Основна задача селекційної роботи – підтримування високопродуктивних штамів – продуцентів.

Важливий метод селекції – відбір мутантів.

Мутант – організм із зміненими спадковими ознаками, які зявляються в результаті мутації.

Мутації є

1. цитоплазматичні (які торкаються позахромосомні генетичні детермінанти)

2. Ядерні (хромосомні) включають

   1. Зміна числа хромосом

   2. зміна числа та порядку розташування генів (генетичні перебудови)

   3. зміна індивідуальних генів (внутришньогенні зміни)

В селекції мікроорганізмів основне значення мають останні два типа мутацій.

Хромосомні перебудови включають:

• Випадіння ділянок хромосоми (делеції)

• Подвоєння числа окремих генів (дуплікації)

• Помноження (ампліфікації) числа окремих генів

• Вставки ділянок хромосом в нові місця (транспозиції)

• Обмін ділянками між хромосомами транс локації

• Зміна розташування генів у хромосомі (інверсії)

Внутришньогенні мутації змінюють послідовність основ ДНК у межах одного гену. При мутаціях зі зсувом рамки у клітинах синтезується неактивний білок зі зміною послідовностей амінокислот.

При транзиціях виникає заміна якого небудь одного пурину (аденіна або гуаніна) або пиримидіна (тиміна або цитозина) на інший пурин або пиримидин відповідно.

При трансверсіях пуринові основи замінюються на одно з двух пиримідинових та навпаки.

Якщо амінокислота, яка кодується мутантним геном, виявляється схожою з амінокислотою, яка кодується диким штамом, то виникає мутантний фенотип з частково порушеною функцією (leaky-мутант).

Важливою характеристикою мутантів є їх здатність до реверсій, т.т зворотньому мутуванню до висхідного фенотипу. Такі мутанти називаються ревертантами (точкові мутації).

За походженням мутації є спонтанні (низька частота виникнення) та індуковані

Наприклад, щоб виявити колонію Lac- (нездатність зброжувати лактозу) серед колоній E/ coli дикого типу (Lac+) необхідно продивитися 100000 клонів.

Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тест-культури мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). Інколи вирощують кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність.

---

Індикаторні чашки - містять середовища з індикатором, якій виявляє різницю рН між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти різняться за коліром колоній та фенотипом. (на агарі з трифенілтетразолієм колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів утворюються прозорі зони.

Метод тест-культур використовують ауксотрофи та чутливі до антибіотиків культури. Характеристику мутантів проводять за зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю колоній.

Метод відбитків (реплік) автори Ледерберг Д. 1952р.

1. Чашки Петрі засівають з розрахунку на чашку 50-200 колоній.

2. Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на металевий циліндр та закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.

3. Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладают чисті чашки з різними середовищами.

4. Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних факторів (температура, фаги, антибіотики).

Метод відбитків можна модифікувати застосуванням безпосередньо у середовищі антибіотиків, які убивають ростучі клітини. Наприклад, ауксотрофний мутант E. Coli за треоніном не росте на мінімальному середовищі без треоніну.В таких умовах пеніцилін буде вбивати лище прототрофні клітини. Якщо необхідна мутація виникла спонтанно з частотою 10 -7, тоді достатньо передивитися декілька тисяч колоній, які вижили після обробки пеніциліном, щоб знайти колонію необхідної мутації.

Якщо це стосується спороутворюючих мікроорганізмів, частку ауксотрофних мутантів можна підвищити прогріванням культур, які проростають у мінімальному середовищі. Прототрофи, які проростуть при нагріванні загинуть, а ауксотрофи, які перебувають у вигляді спор, виживуть та проростуть на збагаченому середовищі.

Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.

Ауксотрофні мутанти представляють значний інтерес для селекції промислових мікроорганізмів. Наприклад, гомосеринові ауксотрофи глутаматпродукуючих коринеподібних бактерій Corynebacterium glutamicum є ефективними продуцентами лізіну. Мутації ауксотрофності можуть підвищувати вихід цілевого продукту, змінюючи регуляцію його біосинтезу. Розповсюджений метод отримання продуктивних штамів – виділення ауксотрофів та відбір псевдоревертантів, які несуть регуляторні мутації. Ауксотрофні мутанти використовують під час отримання рекомбінантних штамів у генетичних схрещеннях.

---

Вміст мутантів у мікробній популяції можна збільшувати шляхом мутагенезу. Вибір мутагену визначається типом мутації, яку бажано отримати, а також ефективність мутагену по відношенні до даного організму.

Таблиця 1

Властивості деяких мутагенів, які використовуються для індукції мутацій у мікроорганізмах.

мутаген	Механізм дії	Тип мутації	ефективність
Радіація · -Рентгенівське опромінення, швидкі нейтрони · -УФ-опромінення	· Розриви хромосом · Димерізація пиримидинів	· Делеції, інверсії · Транзіції, транс версії, делеції	Висока середня
Хімічні агенти · Нитрозогуанидин · Етилметансульфонат · Акридинові фарбники	· Алкіліровання основ у реплікацій ній вілці · Алкіліровання гуаніну · Інтеркаляція між основами під час реплікації	· Транзиції, транс версії, делеції · Мутації зі зсувом рамки зчитування, невелики вставки та делеції	Висока Середня низька
Біологічні агенти · Гени-мутатори · Транспозони (Тп5, Тп10,Тп917)	· Порушення процесів репарації та реплікації ДНК · Вбудова у ДНК	· Транзиції, транс версії · Вставки, делеції, інверсії	Середня Дуже висока
Спонтанні мутації	Дія на ДНК факторів зовнішнього середовища та інтермедіаторів клітинного метаболізму	Транзіції,трансверсії, делеції, вставки	Дуже низька

Індукований мутагенез та відбір продуктивних мутантів є важливим методом підвищення активності промислових штамів мікроорганізмів. При цьому оброблену мутагеном культуру розсівають на щільні поживні середовища з розрахунку отримання окремі колонії. Кожен клон досліджують на продуктивність. Виділив більш продуктивний варіант, процедуру мутагенезу та відбору повторюють тобто проводять ступеневий відбір. В процесі мутагенезу та відбору можуть бути отримані мутації, які призводять до конститутивного синтезу відповідних ферментів, які усувають ретроінгібування, катаболітну та азотну репресії, які підвищують пул попередників цілевого продукту, змінюючи клітинну енергетику та проникність мембран. Саме тому цей метод ефективно використовується для відбору штамів продуцентів антибіотиків.

 Недолік методу - надзвичайно важкий у виконанні. (можуть роками створювати штам, не завжди отримують бажаний результат).

Досягнення молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв’язку кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі метаболіту, або репресує синтез цього ферменту. Наприклад, за наявності глюкози та NH₄⁺ клітини багатьох бактерій синтезують усі необхідні для життєдіяльності азотмісні сполуки. Якщо у середовище додати певну амінокислоту, то її синтез швидко припиняється. В цих умовах виживають лише де які клітини - мутанти з порушеною регуляцією активності та синтезу ферментів. Бажані ті мутанти у яких фермент зберіг функціональну активність, але втратив чутливість до інгибуючої дії кінцевого продукту або його аналога. Синтез ферменту стійкий до надлишку продукту або його аналога. Подібні мутації призводять до появи зверхпродуцентів, які синтезують цільовий метаболіт у аномально високих концентраціях.

---

Якщо необхідно досягти накопичення не кінцевого, а проміжного продукту біосинтетичного шляху тоді використовують мутантів, у яких заблокований наступний за інтермедіатом етап синтезу. Такий мутант ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування речовини, яка є продуктом блокованої реакції.

 В селекції продуцентів ферментів важливе значення має отримання конститутивних мутантів. З цією метою можна використовувати метаболізуючи аналоги субстратів, не здатних викликати індукцію. На чашках, де такі сполуки є єдиним джерелом вуглецю та енергії утворюються колонії лише мутантів, які синтезують відповдні ферменти конституітивно.

 Мутації стійкості до ріфампіцину пошкоджують РНК-полімеразу, а мутації стійкості до стрептоміцину- білок малої субодиниці рибосоми. Стійкість до цих антибіотиків підвищує вихід лізину у штамів продуцентів Corynebacteriumglutamicum. Енергетичний стан клітини може суттєво впливати на процеси біосинтезу у клітині. Наприклад, зверх синтез проліна гистидинзалежними мутантами Brevibacterium flavum повязаний зі збільшенням у них внутрішньоклітинного пула АТФ. Надлишок неорганічного фосфату середовищі, підвищуючи пул АТФ, пригнічує синтез антибіотиків хлор тетрацикліну та кандицидіну продуцентами Strept. Аureofaciens та Strept. Griseus.

 Мутанти, стійки до пеніциліну, бацитрацину, поліміксину, ністатину,кабіцидіну можуть бути селективно отримані на середовищах, які містять інгибуючи концентрації цих антибіотиків. В них часто спостерігається зміна проникності клітинної мембрани, яке підвищує їх продуктивність. Так, стійки до пеніциліну мутанти Cor. Glutamicum продукують на 15-20% більше лізину, ніж висхідні чутливі штами. Мутанти Cephalosporium acremonium стійкі до ністатину, кабіцидину виділяють у середовище більше 10 г/л цефалоспорину С. Мутанти Trichoderma reesei стійкі до кабіцидіну секретують підвищену кількість целюлози.

2. БУДОВА МОЛЕКУЛИ ДНК

Спадкова інформація міститься у геномі - сукупності генів (у випадку вірусів число генів від 3-160) або хромосоморганізму.

Ген – ділянка хромосоми (або молекули ДНК або РНК у вірусів ), яка кодує структуру одного або декількох поліпептидних ланцюгів чи молекул РНК, або ж певну регуляторну функцію.

Кожен ген визначає структуру білка. Одержання продукту білкової природи – одна з головних цілей біотехнології.

Для отримання цінних біотехнологічних продуктів використовують гени самих різних організмів.

ДНК було відкрито у 1896 році швейцарським біохіміком Йоганном Фрідріхом Мішером і було названо «нуклеїн». Пізніше «нуклеїн» був названий «нуклеїновою кислотою» після встановлення Мішером його кислотних властивостей. Довгий час нуклеїнова кислоти вважалася запасником фосфору у організмі. Більш того, багато біологів вважали, що ДНК немає ніякого відношення до передачі спадковості і не може містити закодовану інформацію у зв’язку з одноманітною будовою молекули.

---

Доказ того, що саме ДНК, а не білки, є носієм спадкової інформації надали дослідження О.Евері, Коліна Мак-Леода та Маклін Мак-Карті ( 1944р.) по трансформації б актерій. Було доведено можливість надання не хвороботворній культурі хвороботворних властивостей шляхом додавання мертвих хвороботворних бактерій (пневмококов).

Американські вчені Альфред Херші та Марта Чейз (1952р.) мітили радіоактивними ізотопами білки та ДНК бактеріофагу і показали, що у заражену клітину передається лише нуклеїнова кислота бактеріофагу, а нові нащадки містять таки самі білки та нуклеїнову кислоту як і висхідний фаг.

Проте, точну будову ДНК та спосіб передачі спадкової інформації був невідомий.

У 1953 році використовуючи рентгеноструктурні данні, отримані Морисом Уілкінсом та Розаліндою Франклін , а також відкриття Е . Чаргаффом нуклеотидного складу ДНК, Френсіс Крик та Джеймс Уотсон запропонували подвійну структуру спіралі молекули ДНК. Згідно цієї структури у кожній молекулі ДНК чітко зберігаються співвідношення азотистих основ різних типів. За цю роботу вони отримали у 1962 році Нобелівську премію по фізіології та медицині.

Нуклеїнові кислоти це високомолекулярні сполуки, які містяться у всіх живих клітинах і представлені ДНК та РНК.

Нуклеїнові кислоти являють собою лінійні біополімери, побудовані з нуклеотидів, з’єднаних фосфордиефірним зв’язком.

Молекула ДНК – це лінійний полімер. Він складається з мономерів=нуклеотидів.

Нуклеотиди - це сполуки, що складаються з залишків азотистої (гетероциклічної) основи , п’ятивуглеводного цукру (пентозного компоненту) та фосфорної кислоти . Вони є мономерними одиницями олігонуклеотидів.

Нуклеозид – сполука, яка утворюється відщепленням від нуклеотиду фосфорної кислоти.

Вуглеводи . У складі нуклеїнових кислот гетероциклічні основи зв’язані з моноцукрами D-рибозою (дві ОН-групи ) у РНК або з 2-дезокси- D-рибозою (одна ОН-група) у ДНК.

Пентозний компонент до 5′-атому вуглецю приєднує фосфатну групу, а до 1′-атому вуглецю приєднує органічну основу.

Гетероциклічні основи представляють собою похідні пиримідину (цитозин, урацил – лише у РНК, тимін – лише у ДНК) або пурину (аденін, гуанін).

Нуклеотиди з’єднані один з одним фосфордиефірними зв’язками – фосфатна група 5′-вуглецевого атому одного нуклеотиду зв’язується з 3′-ОН групою дезоксирибози сусіднього нуклеотиду. Таким чином, на одному кінці полінуклеотидного ланцюга знаходиться 3′-ОН-група (3′-кінець), а на другому 5′-фосфатна група (5′-кінець).

3′-кінець – це розміщений нуклеотид з вільною ОН-групою у третьому вуглецевому атомі рибози або дезоксирибози.

5′-кінець – кінець полінуклеотиду, на якому розміщений нуклеотид з вільною фосфатною групою п’ятого атому вуглецю рибози або дезоксирибози. З 5′-кінець починається синтез полінуклеотидних ланцюгів у процесах реплікації, транскрипції і репарації.

---