У еукаріот виникає процессинг білків- поліпептидний ланцюг розщеплюється в певних сайтах з утворенням коротких білкових молекул зі специфічними функціями.

В деяких випадках до певних амінокислот приєднуються фосфатні групи, ліпиди, вуглеводи та інші низькомолекулярні сполуки.

В результаті хімічних модифікацій утворюються білки.

Генетичний словник складається з 64 кодонів, 3 з них це стоп кодони, а 1 – старт-кодон, якій ще кодує амінокислоту метіонін.

Не дивлячись на відмінності, генетичний код у всіх організмів однаковий (за рідким виключенням).

Рибосома дисоціює на субодиниці, які можуть знову приймати участь у трансляції.

повернутися до змісту

РЕГУЛЯЦІЯ ТРАНСКРИПЦІЇ У БАКТЕРІЙ.

Усі процеси, які перебувають у бактерійній клітині потребують участі білків.

Проте енергетичних ресурсів клітини не стає для одночасного здійсненнятранскрипції та трансляції (експресії) усіх структурних генів.

Тому постійно експресіруються лише ті гени, які кодують білки для підтримки основних клітинних функцій, а транскрипція інших структурних генів регулюється.

Нуклеотидна послідовність, в якій закодовано більш одного білка називається оперон.

Оперон знаходиться під контролем єдиного промотора та при його транскрипції утворюється одна довга молекула мРНК, яка кодує декілька білків.

В більшості структурних генів є два сайта зв’язування для РНК –полімерази.

Оператор – ділянка ДНК, яка регулює транскрипцію оперона

Репресор – білок, здатний взаємодіяти з оператором гена і блокувати його транскрипцію (заважає переміщенню РНК-полімерази впродовж молекули ДНК)

Корепресор – специфічний ефектор, якій зв'язується з неактивним репресором і викликає конформаційні зміни останнього, які дозволяють зв'язуватися з оператором.

Лекція № 4. Генетична інженерія. Технології рекомбінантних ДНК

БІОТЕХНОЛОГІЯ У ВЕТЕРИНАРНІЙ МЕДИЦИНІ

Ветеринарна медицина.

Факультет ветеринарної медицини.

Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології.

ТЕМА ЛЕКЦІЇ: ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ.

ТЕХНОЛОГІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

АВТОР: НОВІЦЬКА О.В., кандидат ветеринарних наук

АНОТАЦІЯ

Викладено інформацію щодо сукупності експериментальних процедур, які дозволяють проводити перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму у другий.

Метою вивчення лекційного матеріалу є засвоєння теоретичних основ методики конструювання рекомбінантних ДНК.

План лекції:

І. Технологія рекомбінантних ДНК

a. схема отримання рекомбінантних днк

b. ферменти, які використовують у генній інженерії

c. утворення липких та тупих кінців

d. картування сайтів рестрикції

ІІ. Вектори

a. вимоги до векторів

b. трансформація та відбір клітин-донорів

c. ідентифікація клітин з рекомбінантною ДНК

ЗМІСТ ЛЕКЦІЇ

І. ТЕХНОЛОГІЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

Технологія рекомбінантних ДНК (молекулярне клонування, генна інженерія) – сукупність експериментальних процедур, які дозволяють проводити перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму у другий.

---

Гена інженерія це конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур тобто створення штучно генетичних програм.

Основне завдання прикладної генної інженерії – конструювання рекомбінантних ДНК, які можуть надати клітинам-реципієнтам здатність до синтезу таких речовин як гормони, інсулін, соматотропні, інтерферон, урокіназу та ін.

Створенню методики рекомбінантних ДНК передували відкриття у галузях молекулярної біології, ензимології нуклеїнових кислот, молекулярної генетиці вірусів та поза хромосомних елементів бактерій (бактерій).

Формально датою народження генної інженерії можна вважати 1972 рік, коли амеріканці Герберт Бойер, Пол Берг і Стенлі Коен запропонували новаторський підхід об’єднання біохімії з технологіями, вони розробили рекомбінантну ДНК, яка поєднала ДНК людини та бактерії. Вчені винайшли спосіб перетворення бактерій у «фабрики» по виготовленню таких важливих для людини білків як інсулін та гормон росту.

Приблизна схема отримання рекомбінантних ДНК:

1. З організму донора екстрагують нативну ДНК, з наступним ферментативним гідролізом (розрізають) та з’єднують (лігують) з іншою ДНК (клоную чим вектором), в результаті чого отримують рекомбінантну молекулу (конструкція «вектор-ДНК»).

2. Цю конструкцію вводять у клітину-господаря (реціпієнт), там вона реп лікується та передається нащадкам. Цей процес називається трансформацією.

3. Ідентифікація та відбір клітин, які несуть рекомбінантну ДНК.

4. Синтез клітинами-господарями специфічного білкового продукту, що є підтвердженням клонування необхідного гена .

Конструювання рекомбінантних молекул можливо лише за умов використання великої кількості ферментів, які є обов’язковими та незамінними інструментами у процесі отримання рекомбінантних ДНК.

ФЕРМЕНТИ, ЯКІ ВИКОРИСТОВУЮТЬ У ГЕННІЙ ІНЖЕНЕРІЇ.

Для клонування важливо отримати окремі специфічні ділянки (сайти) донорної та векторної ДНК.

Якщо пропустити хромосомну ДНК через шприц з голкою малого діаметру або обробити ультразвуком, ми можемо отримати фрагменти від 0,3- до 5 т.п.н. Нажаль, розриви під час таких маніпуляцій виникають випадково і не повторюються при наступній обробці.

Отримати специфічні ділянки ДНК стало можливо після виділення ферментів, які впізнають певні послідовності основ у дволанцюговій молекулі ДНК і розщеплюють обидва ланцюги. Ці ферменти називаються рестрикуючи ендонуклеази типа ІІ.

Перша рестриктаза була виділена у 1968 році Мезельсоном і Юанем.

Одна з перших ендонуклеаз рестрикції типа ІІ була виділена з бактерії Escherichia coliта отримала назву EcoRI.

Цей фермент впізнає ділянку ДНК, яка містить специфічну паліндромну послідовність (послідовність-перевертень, яка однаково читається у напрямку 5-3) з 6 пар основ та вносить розрив між залишками гуаніна та аденіна. При цьому розщеплюється зв'язок між атомом кисню при 3-атомі вуглецю цукрового залишку одного нуклеотиду та фосфатною групою, приєднаною до 5-вуглецевого атому цукрового залишку сусіднього нуклеотиду. Розриви у ланцюгу відбуваються таким чином, що утворюються так звані «липки кінці».

---

«Липкий кінець» - вільний одноланцюговий кінець дволанцюгової ДНК,комплементарний одно ланцюговому кінцю, що належить цій самій або іншій молекулі ДНК.

Є такі ендонуклеази, які розщеплюють ланцюги строго один напроти одного тоді утворюються фрагменти ДНК з «тупими кінцями».

Кожен одноланцюговий хвіст закінчується 5-фосфатною групою, а 3- гідроксильна група протилежного ланцюга ніби втоплена.Отримано біля сотні ендонуклеаз рестрикції типу ІІ. Назви для них складаються з літер роду та виду. Римськи цифри – номер ендонуклеази, яку виділили з мікроорганізму.

Наприклад:

Escherichia coli - EcoRI.

Haemophilus parainfluenzae – HpaI, HpaII

Паліндромні послідовності, які розпізнаються ендонуклеазами рестрикції типа ІІ і в яких виникає розщеплення називаються «сайтами впізнання».

Сайти впізнання можуть складатися з 4, 5, 6, 8 та більше пар нуклеотидів. Від довжини «сайта впізнання» залежить частота його розповсюдження у молекулі ДНК.

ферменти	Сайт впізнання	Характер розщеплення
EcoR I	G AATTC CTTAA G	Липкі кінці
BamH I	G GATCC CCTAG G	Липкі кінці
Pst I	CTGCA G G ACGTC	Липкі кінці
Sau3A I	GATC CTAG	Липкі кінці
Pvu II	CAG CTG GTC GAC	Тупі кінці
Hpa I	GTT AAC CAA TTG	Тупі кінці
Hae III	GG CC CC GG	Тупі кінці

Якщо неодноразово обробляти зразок ДНК певною рестриктазою (при умові, що розщеплення проходить по всім сайтам рестрикції) тоді утворюється один і той самий набір фрагментів. Якщо використовувати декілька ферментів рестрикції окремо, а потім обробити ДНК комбінаціями, можна побудувати фізичну карту рестрикції (послідовність сайтів рестрикції). Визначив розмір отриманих фрагментів за допомогою гель-електрофорезу, можна знайти положення рестрикційних сайтів.

Проте для молекулярного клонування одних ферментів рестрикції недостатньо:

v Водневий зв'язок між чотирма основа, які утворюють липкі кінці слабкий і не може утримати два фрагмента ДНК, які об’єдналися. Тому використовують фермент ДНК –лігазу бактеріофагу Т4. Він каталізує утворення фосфодиефірних зв’язків (відновлює зв'язок між 3-гідроксильною групою одного ланцюга та 5-фосфатною групою другого ланцюга) між кінцями полінуклеотидних ланцюгів, які утримуються між собою завдяки спарюванню липких кінців.

Також ДНК-лігаза Т4 зшиває тупі кінці, які наближаються, коли об’єднані фрагменти зв’язуються з ферментом.

v Об’єднання різних молекул ДНК не має сенсу, якщо утворенні рекомбінантні ДНК не будуть реплікуватися у клітині-господарі.

v Під час рестрикції ДНК утворюється суміш різних фрагментів, які після лігування з векторною ДНК утворюють багато комбінацій. Для їх розпізнання застосовують різні системи скринінгу.

повернутися до змісту

ІІ. ВЕКТОРИ

Вектор – молекула ДНК, що має здатність до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку можна ввести додатковий фрагмент чужорідної ЖНК і забезпечити його реплікацію.

---

Плазміди- це поза хромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, які реплікуються автономно.

Плазміди мають розміри від 1 до 500 т.п.н. Кожна з них несе сайт ініціації реплікації(ori), без якого плазміда не зможе реплікуватися у клітині.

Всього плазмідної ДНК 0,1-5,0% сумарної клітинної ДНК.

Якщо дві та більше плазмід не можуть існувати у одній клітині тоді вони належать до одної групи несумісності. Плазміди різних груп несумісності безперешкодно існують у одній клітині.

ВИМОГИ ДО ВЕКТОРІВ:

v Невеликий розмір (ефективність перенесення екзогенної ДНК у E.coli знижується при довжині плазміди більше 15 т.п.н.).

v Наявність унікального сайту рестрикції, в якій можна вставити екзогенну ДНК.

v Наявність селективних генетичних маркерів для ідентифікації реципієнт них клітин, які несуть рекомбінантну ДНК.

Тому плазмідні вектори створюють за допомогою генної інженерії.

Плазмідний вектор pBR322 був одним з найпопулярніших векторів 80 років 20 ст. Цю плазміду створили Ф.Болівар та Р.Родригес. Довжина плазміди 4361 п.н.

Вона несе два гена стійкості до антибіотиків – ампіциліну та тетрацикліну, а також унікальні сайти для BamHI, HindIII, SalI в гене Tet^r, один сайт PstI в гені Amp^r, один сайт для EcoRI. Також є сигнал початку реплікації виключно у ешеріхії. В інші бактерійні клітини переноситься важко.

Як працює клонуючий вектор?

Плазміду обробляють рестриктазою, яка розщепляє кільце плазміди лише в одному сайті одного з генів стійкості. Таким чином утворюється лінійна молекула з липкими кінцями.

Такі молекули змішують з попередньо обробленою рестриктазами донорною ДНК (яка містить необхідний ген). Така ДНК теж має липкі кінці.

Оскільки липкі кінці цих двох ДНК комплементарні, вони спарюються з утворенням гібридних молекул.

Потім суміш обробляють ДНК-лігазою фага Т4 у присутності АТР.

В результаті утворюються

· різні комбінації фрагментів

· об’єднані фрагменти донорної ДНК

· об’єднані фрагменти плазмідної ДНК

Щоб зменшити кількість об’єднаних фрагментів плазмідної ДНК, рестрикційну ДНК обробляють лужною фосфатазою, яка відщеплює від лінеарізованої молекули ДНК 5-фосфатні групи. ДНК-лігаза не може зшити дефосфорильовані кінці плазмідної ДНК.

Рекомбінантні молекули ДНК мають два одно ланцюгових розриву, проте її фрагменти тримаються разом двома фосфордиефірними зв’язками, які утворюються між дефосфорильованою плазмідною ДНК та рестрикованою донорною ДНК. Після реплікації у трансформованій клітині одноланцюгові розриви лігуються системою клітини-господаря (рис. 26).

ТРАНСФОРМАЦІЯ ТА ВІДБІР.

Щоб створити копії рекомбінантних ДНК необхідно ввести її у клітину-господаря. Цей процес називається трансформацією.

Практично трансформація досягається змішуванням клітин-хазяїв та суміші ДНК. Для досягнення більшої ефективності клітини піддають дії високих температур, обробляють CaCl₂. Проте ефективність трансформації залишається невисокою, як правило трансформації піддаються одна з тисячі клітин.

---

Більшість клітин не містять рекомбінантні ДНК. В деяких з них є об’єднана плазмідна ДНК, в інших неплазмідна ДНК, і лише в поодиноких гібридомна плазміда.

Потім необхідно провести ідентифікацію клітин, які містять рекомбінантну ДНК.

Ідентифікація складається з двох етапів. Клітини після трансформації висівають на поживні середовища з ампіциліном – виростають клітини з інтактним геном Amp^r або у складі плазміди pBR322 або у складі гібридомної плазміди.

Клітинний клон – це популяція клітин (колонія), які є нащадками однієї клітини і тому містять той самий генетичний матеріал що і попередник (є точними копіями спільного предка)

Усі системи клонування відповідають 2 основним вимогам:

1. Наявність декількох сайтів для клонування

2. Можливість простої ідентифікації клітин з рекомбінантними ДНК

Для усіх рутинних процедур молекулярного клонування широко використовуютьE.coli, але також часто у якості господарів використовують Bacillus subtilis,Agrobacterium tumefaciens.

Особливості клонування структурних генів еукаріот:

Ø Прокаріоти не можуть видаляти інтрони з первинних РНК-транскриптів, тому правильна трансляція еукаріотичної мРНК у бактеріальній клітині не можлива

Ø Експресія еукаріотичної ДНК може відбуватися лише за наявності прокаріотичних сигнальних послідовностей, які регулюють транскрипцію та трансляцію

Різні кДНК можна вбудовувати у плазмідний вектор.

Вектори для клонування великих фрагментів ДНК.

Вектори на основі бактеріофагу λ.

За допомогою плазмідних векторів можна клонувати фрагменти ДНК довжиною до 10 т.п.н. Проте інколи треба працювати з великими фрагментами ДНК. Для цього були розроблені вектори на основі бактеріофага λ.

Клонуюча система на основі бактеріофагу

Фагова ДНК має два BamHI-сайта, фланкуючих І/Е-сегмент (інтеграції та виключення).

Клонувальну ДНК розщеплюють за допомогою BamHI, відбирають сегменти розміром 15-20 т.п.н.

Фагову ДНК розщеплюють за допомогою BamHI. Під час гідролізу очищеної фагової ДНК рестриктазою утворюються три фрагмента:

· ліве плече (L)-містить інформацію про головку та хвіст

· Праве плече (R) відповідає за реплікацію ДНК та лізис

· Середній фрагмент- несе гени, які відповідають за процеси інтеграції та виключення.

Завдання – замінити цей центральний сегмент необхідною послідовністю ДНК.

Обидва препарати змішують та обробляють ДНК-лігазою фага Т4.

У результаті змішування отримують:

· Відновлену ДНК фага λ.

· Рекомбінантні молекули, які містять R і L-ділянки фагової ДНК та вставку клонованої ДНК розміром до 20 т.п.н., яка займає місто І/Е-сегмента.

Рекомбінантні молекули довжиною 50 т.п.н. упаковують у пусті головки бактеріофага in vitro, додають відростки та отримують інфекційні фагові частки. Фрагменти більше 52 та менше 38 т.п.н. упаковуватися не можуть.

Рекомбінантний фаг може розмножуватися лише у штамах E.coli, які не забезпечують розмноження фага з інтактним І/Е-сегментом.

---