ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 27.11.2019
Просмотров: 3466
Скачиваний: 4
МОДУЛЬ 1. ЦИТОЛОГИЯ
КАК НАУКА
Лабораторная работа 2
Цитология с основами гистологии. Лаб. практикум
16
апохроматы изготавливают с высокой нумерической апертурой. В них устра-
нены сферическая и хроматическая аберрации. Объективы
-
апохроматы при-
меняются в сочетании с компенсационными окулярами.
Характеристики не-
Каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего
расстояния в миллиметрах. При работе с объективами следует соблюдать ос-
торожность, чтобы не повредить линзы. Особенно это важно при работе с
объективами с большим увеличением, для которых рабочее
расстояние
(рас-
стояние между поверхностью покровного стекла и линзой объектива) состав-
ляет 0,10
–
0,12 мм.
Фокусирование на объект осуществляют перемещением тубусодержа-
теля. Грубую фокусировку производят вращением рукояток макровинта, рас-
положенных по обеим сторонам тубусодержателя. Диапазон грубой
фокуси-
ровки микроскопа
–
40 мм. Тонкую фокусировку производят с помощью
микровинта, выполненного в виде диска с накаткой. Один оборот диска соот-
ветствует перемещению тубусодержателя на 0,5 мм, а вращение диска от
упора до упора
–
не менее 2 мм. Перед началом работы необходимо устано-
вить рукоятку тонкой фокусировки приблизительно в среднее положение.
Таблица 2
Некоторые характеристики объективов
Объективы
Увеличение, числовая апертура,
наличие иммерсии
Рабочее расстояние, мм
Планахроматы
9 х 0,20
13,13
10 х 0,20
13,13
Ахроматы
8 х 0,20
8,53
20 x 0,40
1,70
40 х 0,65
0,41
85 х 1,00 (ВИ)*
0,18
9
0 х 1,25 (МИ)**
0,10
Апохроматы
10 х 0,30
4,80
20 х 0,65
0,67
90 х 1,3
0,12
Примечание
: *
водная иммерсия
; **
масляная иммерсия
.
Препарат крепят на предметном столике
с помощью клемм или держа-
телей. Предметные столики могут быть различной формы, вращаемыми, ос-
нащенными препаратоводителями с координатным перемещением объекта.
В последних держатели можно перемещать относительно друг друга (в зави-
симости от размера предметного стекла) при помощи винтов
).
Осветительные устройства
могут быть вынесенными, накладными
и встроенными. В случае вынесенного осветителя используется зеркало. Оно
имеет две отражающие поверхности: плоскую и вогнутую. Вогнутую по-
верхность используют при естественном освещении, в отдельных случаях
она может служить для повышения освещенности объекта. Накладные осве-
МОДУЛЬ 1. ЦИТОЛОГИЯ
КАК НАУКА
Лабораторная работа 2
Цитология с основами гистологии. Лаб. практикум
17
тители ОИ
-
32М или ОИ
-
35 вставляют в посадочное гнездо в основании мик-
роскопа. Встроенный в основание микроскопа осветитель включает галоген-
ную лампу, коллекторную линзу, вблизи фокуса которой располагается нить
лампы.
Р
Р
а
а
з
з
р
р
е
е
ш
ш
а
а
ю
ю
щ
щ
а
а
я
я
с
с
п
п
о
о
с
с
о
о
б
б
н
н
о
о
с
с
т
т
ь
ь
о
о
б
б
ъ
ъ
е
е
к
к
т
т
и
и
в
в
а
а
Каждый объектив характеризуется определенной разрешающей спо-
собностью, фокусным расстоянием (глубиной резкости) и увеличением.
Разрешающая способность объектива микроскопа
(
d
) –
наименьший
диаметр частицы, которую можно увидеть при данном объективе, или то
наименьшее расстояние между двумя линиями, при котором они видны как
отдельные. Разрешающая способность объектива микроскопа зависит от зна-
чений нумерической (числовой) апертуры (
A
)
объектива и конденсора и дли-
ны волны источника света (λ). Для пучка лучей, параллельных оптической
оси микроскопа, разрешающую объектива микроскопа определяют по фор-
муле
d
=
λ
/
A
.
Для наклонных лучей разрешающая способность в 2 раза выше:
d
=
λ
/2
A
,
где
λ
–
длина волны, нм;
А
–
числовая апертура объектива.
Длина волны лучей источника света в видимой части спектра может
меняться от 0,4 мкм (400 нм) для фиолетовых лучей до 0,7 мкм (700 нм) для
красных. Следовательно, чем короче длина волны лучей источника света
и чем больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объ-
ектива микроскопа, т. е. тем более тонкие структуры мы сможем увидеть
в микроскоп. При освещении объекта наклонными лучами разрешающая
способность объектива микроскопа в 2 раза выше, чем при освещении прямо
падающими лучами. Освещая препарат синими лучами (
λ = 0,47
мкм),
т. е. применяя в осветителе синий светофильтр, можно изучать более тонкие
структуры, чем при освещении обычным белым светом.
Пример: для объектива с
A
=
1,4 при освещении белым светом (λ
=
=
0,55 мкм)
диаметр наименьшей видимой частицы при прямо падающем
свете равен 0,39 мкм, при косом освещении
–
0,20 мкм, а при освещении си-
ним светом
–
0,34 и 0,17 мкм соответственно. Максимальное разрешение,
которое можно получить при использовании светового микроскопа
– 0,20
–
0,35 мкм. Увеличить разрешающую способность можно при использовании
ультрафиолетового света (длина волны 0,26
–
0,28 мкм), что позволяет полу-
чить разрешение 0,13
–
0,14 мкм.
МОДУЛЬ 1. ЦИТОЛОГИЯ
КАК НАУКА
Лабораторная работа 2
Цитология с основами гистологии. Лаб. практикум
18
Ч
Ч
и
и
с
с
л
л
о
о
в
в
а
а
я
я
а
а
п
п
е
е
р
р
т
т
у
у
р
р
а
а
о
о
б
б
ъ
ъ
е
е
к
к
т
т
и
и
в
в
а
а
Числовая, или нумерическая
,
аперту-
ра (
А
) объектива характеризует светособи-
рательную способность и определяется по
формуле
A
=
n
·sin
α
,
где
n
–
показатель преломления среды меж-
ду фронтальной линзой объектива и по-
кровным стеклом; α
–
половинный угол
входного отверстия объектива (угол, одна
сторона которого совпадает с оптической
осью, другая образована линией, соеди-
няющей точку выхода лучей из объектива
с границей действующего отверстия объек-
тива)
О
О
б
б
щ
щ
е
е
е
е
у
у
в
в
е
е
л
л
и
и
ч
ч
е
е
н
н
и
и
е
е
м
м
и
и
к
к
р
р
о
о
с
с
к
к
о
о
п
п
а
а
Увеличение объектива указано на оправе, там же указана и числовая
апертура. Конденсоры тоже имеет определенную числовую апертуру. Если
апертура конденсора меньше апертуры объектива, то возможности объектива
таким образом используются в работе неполностью.
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увели-
чения объектива (
V
об
) на увеличение окуляра(
V
ок
):
V
=
V
об
·
V
ок
.
Если объектив имеет увеличение 90х, а окуляр 15х, то общее увеличение
равно 1350. Увеличения, превышающие эту величину, не имеют значения
,
и
их называют бесполезными. Это связано с тем, что структуру препарата оку-
ляр может увеличить настолько, чтобы она просматривалась под тем же уг-
лом зрения
,
что и в объективе.
Это увеличение называется полезным, и оно
равно 1000
А
. Расчеты показывают, что полезное увеличение не может пре-
вышать 1300
–
1450 раз. Большее увеличение не выявляет новых деталей на
изображении, а освещенность его становится меньше.
Рис. 2. Угол отверстия
объектива микроскопа: Об
–
объ-
ектив; Кн
–
конденсор; Р
–
плос-
кость препарата;
F
–
фронтальная
плоскость; α
–
угол отверстия
объектива
МОДУЛЬ 1. ЦИТОЛОГИЯ
КАК НАУКА
Лабораторная работа 2
Цитология с основами гистологии. Лаб. практикум
19
Г
Г
л
л
у
у
б
б
и
и
н
н
а
а
р
р
е
е
з
з
к
к
о
о
с
с
т
т
и
и
и
и
з
з
о
о
б
б
р
р
а
а
ж
ж
е
е
н
н
и
и
я
я
Глубина резкости изображения
(глубина фокуса)
–
способность объек-
тива одновременно давать резкие изображения точек, находящихся от него
на разном расстоянии, или глубина препарата, видимая одновременно резко.
Она зависит от увеличения микроскопа и апертуры объектива. Каждый объ-
ектив позволяет видеть препарат на определенную глубину в одной плоско-
сти. На большом увеличении необходимо поочередно фокусировать объек-
тив в разных плоскостях. На малых увеличениях и малой апертуре глубина
резкости больше, чем при больших увеличениях. Показатель глубины резко-
сти следует особенно учитывать при микрофотографии, когда необходимо
четко видеть изображение объекта в одной плоскости зрения. Глубина резко-
сти
(
T
) –
это глубина препарата, видимая одновременно резко. Её определяют
по формуле
T
= (1000/7
A
·
V
) + (
λ/2
A
2
).
При небольших увеличениях и малой апертуре глубина резкости боль-
ше, чем при больших увеличениях и высокой апертуре.
Качество микроскопа определяется не увеличением, а разрешающей
способностью оптических устройств.
В случае сухих объективов (без использования жидких сред
–
иммер-
сии) коэффициент преломления равен единице
(
n
=
1) и
NA
< 0,95.
При иммерсионной
системе у объектива
микроскопа пространство ме-
жду фронтальной линзой и рассматриваемым предметом заполнено жидко-
стью с более высоким показателем преломления, чем воздух. Для иммерси-
онных объективов нумерическая апертура зависит от показателя преломле-
ния жидкости, находящейся между препаратом и объективом. Поэтому для
водно
-
иммерсионных объективов
NA
меньше либо 1,25 (вода имеет
n
= 1,33),
а для масляно
-
иммерсионных объективов
NA
меньше либо равно 1,4 (кедро-
вое масло имеет
n
представлен ход лучей при использова-
нии масляной иммерсии и сухого объектива.
МОДУЛЬ 1. ЦИТОЛОГИЯ
КАК НАУКА
Лабораторная работа 2
Цитология с основами гистологии. Лаб. практикум
20
Рис. 3. Сравнение хода лучей при использовании сухого (слева) и иммерсионного
масляного (справа) объективов
Как видно из этого рисунка, в сухой системе некоторая часть лучей
не попадает в объектив, так как
при выходе из покровного стекла, они откло-
няются. Лучи, которые в месте выхода к поверхности стекла образуют угол
больше 41
°
(предельный угол), полностью отражаются. Для стекла и воды
предельный угол равен 41°, для кедрового масла и стекла он не существует
по причине равенства показателей их преломления. Для улучшения качества
изображения часто применяется полная иммерсия, когда иммерсионную
жидкость наносят и на конденсор.
При работе с иммерсионными объективами следует соблюдать осто-
рожность, чтобы при опускании тубуса не повредить линзу.
Иммерсионную жидкость наносят между линзой и объективом в виде
капли на поверхность покровного стекла препарата и, опуская затем тубус,
погружают линзу в каплю иммерсии. Иммерсионную жидкость можно нанес-
ти и на поверхность линзы объектива либо по капле и на препарат, и на объ-
ектив. Главное требование
–
создание иммерсии без пузырьков воздуха.
Только в случае соответствия апертур коллектора осветителя, конден-
сора и объектива разрешающая способность оптики микроскопа использует-
ся полностью.
Задание 1.
Ознакомиться с объективами, окулярами и конденсором
биологического микроскопа. Приготовить временный препарат кожицы лука
и рассмотреть его при разных длинах волн, используя цветные светофильт-
ры, красный и синий. Зарисовать препарат при трех длинах волн. Опреде-
лить, при какой длине волны видны более мелкие детали. Рассчитать разре-
шающую способность и глубину резкости. Результаты занести в