ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 08.11.2023
Просмотров: 20
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Занятие № 4
Тема: «Лабораторная диагностика дифтерии».
-
Актуальность темы: Дифтерия — это острое инфекционное заболевание, характеризующееся воспалительным процессом с образованием фибринозной пленки на месте внедрения возбудителя и явлениями общей интоксикации. Инфекция остается контагиозной и опасной инфекцией в связи с тяжелым течением и летальностью. Отличается управляемостью при четкой организации иммунопрофилактики и создания коллективной иммунной прослойки (96%). -
Учебные цели занятия:
Знать:
1. Морфологию и культивирование коринебактерий.
2. Эпидемиологию и патогенез заболевания.
3. Характеристику токсинов и их роль в патогенезе дифтерии.
4. Клинические формы и симптомы дифтерии.
5. Лабораторную диагностику.
6. Лечение и профилактику дифтерии.
Уметь:
1. Проводить микроскопические исследования по Граму, Нейссеру для выделения возбудителя дифтерии.
2. Проводить исследования для определения токсигенности коринебактерий.
3. Освоить технику постановки РНГА, для определения иммунитета в сыворотке крови людей.
5. Выбирать биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии дифтерии.
6. Освоить технику применения антитоксической противодифтерийной сыворотки.
3. Цели развития личности (деонтологические, экологические, правовые, профессиональные, психологические, патриотические и др. аспекты)
4. Оснащение: дидактический материал и технические средства обучения (тематический пациент; кино‑ и видеофильмы, тренинговые и контролирующие компьютерные программмы, мультимедийные атласы, альбомы, ситуационные задачи, деловые игры, фантомы, тренажеры и др.)
5. Материалы для самоподготовки:
5.1. Вспомогательный учебный материал
Морфология. Коринебактерии дифтерии - это тонкие плеоморфные палочки длиной 3-6 мкм, шириной 0,6-0,8 мкм с булавовидными утолщениями на одном или обоих концах. Они не образуют спор и капсул, неподвижны, грамположительные, но легко обесцвечиваются. Клетки часто образуют септы, часто наблюдают разветвления. Внутри клеток расположены полиметафосфатные гранулы, которые лучше окрашиваются по Граму, чем остальная бактериальная клетка. При окраске по Леффлеру метиленовым синим гранулы приобретают лазурно-пурпурный цвет, в связи с чем они получили название метахроматических гранул (или волютиновых, или зёрен Бабеша-Эрнста). Часто они расположены на полюсах бактерий и их называют полярными телами. Специальные методы окраски (по Альберту, Нейссеру и Пондеру) позволяют чётко продемонстрировать их наличие. В мазках коринебактерии дифтерии располагаются достаточно характерно - парами или небольшими группами, под острым или прямым углом, в виде латинских букв V и L. Подобное расположение часто называют “китайскими буквами” или “клиновидным”. Это происходит вследствие неполного отделения дочерних клеток после бинарного деления.
Культивирование. Коринебактерии дифтерии плохо растут на обычных средах; для культивирования нужны среды, обогащены кровью, сывороткой или яйцами. Оптимальной температурой для роста является 37ºC (от 15 до 40ºC), оптимальной рН - 7,2. Бактерии являются аэробами и факультативными анаэробами.
Средами, которые используют для культивирования дифтерийных бактерий, являются скошенный сывороточный агар Леффлера и теллуритовый кровяной агар. Бактерии очень быстро растут на агаре Леф-флера с образованием первых колоний через 6-8 часов, задолго до того, как вырастают другие бактерии. На первых порах колонии имеют вид небольших круглых белых непрозрачных дисков, но при продолжении инкубации увеличиваются в размерах и приобретают характерный жёлтый оттенок. Теллурит (0,4 %) угнетает рост большинства других бактерий, выступая в качестве селективного агента. Дифтерийные бактерии редуцируют теллурит до металлического теллурия, который входит в состав колоний и окрашивает их в серый или чёрный цвет.
Классификация. На основе изучения морфологии колоний, которые выросли на теллуритовой среде и других свойств, Маклеод выделил 3 типа дифтерийных бактерий: gravis, intermedius и mitis, недавно был добавлен четвертый тип - belfanti. Названия были предложены для обозначения степени тяжести болезни, которую эти типы вызывали: gravis вызывал наиболее тяжёлое заболевание, mitis – наименее тяжёлое, а intermedius находился посредине, однако в настоящее время эта связь непостоянна. Однако определенные биологические признаки этих типов имеют относительную ценность: типы gravis и intermedius в большинстве случаев вызывают развитие параличей и летальный исход, а инфекции mitis вызывают обструкционные поражения дыхательных путей. Штаммы mitis превалируют в эндемических районах, а типы gravis и intermedius являются эпидемическими. Тип mitis может выступать как комменсал в макроорганизме. В популяциях людей с природным или искусственно созданным иммунитетом типы gravis и, в меньшей степени, intermedius распространяются более быстро, чем mitis.
Лабораторная диагностика. Лабораторное подтверждение дифтерии необходимо для эпидемиоло-гического контроля и разработки профилактических мероприятий, а не для лечения больных. Специфическое лечение следует назначать немедленно при подозрении на дифтерию, не дожидаясь результатов лабораторных тестов, любая задержка может стать роковой.
Целью лабораторной диагностики является изоляция дифтерийных бактерий и демонстрация их токсичности. Берут 1-2 образца с пораженных участков с помощью шпателя. Бактерии не всегда выявляют в мазках с пораженного участка, а также их не всегда можно отличить от комменсалов, которые составляют нормальную микрофлору глотки. Таким образом, только бактериоскопического исследования недостаточно для постановки диагноза “дифтерия”, но оно является важным в диагностике ангины Винсента.
Для этого мазок красят по Граму или Лейшману и изучают спирохеты Винсента и фузиформные бактерии. Токсигенные коринебактерии дифтерии можно выявить в мазках методом иммунофлюоресценции. Для культивирования материал переносят на свернутую сыворотку Леффлера, теллуритовый кровяной агар и чашку с обычным кровяным агаром (для дифференцирования от стафилококкового или стрептококкового фарингита, которые могут симулировать дифтерию). Если материал невозможно сразу перенести в питательную среду, его нужно сохранять смоченным стерильной сывороткой для сохранения жизнеспособности бактерий. На свернутой сыворотке рост можно наблюдать уже через 4-8 часов, но при его отсутствии следует инкубировать культуру еще 24 часа.
В мазках, окрашенных метиленовым синим или одним из специальных методов (по Нейссеру или Альберту) выявляют бактерии с метахроматическими гранулами и типичным расположением. Культуры на теллуритовом агаре следует инкубировать минимум 2 дня, поскольку в некоторых случаях рост может быть замедленным. Теллуритовая среда играет значительную роль в изоляции коринебактерий дифтерии от носителей, лиц, которые переболели дифтерией или контактировали с больными, поскольку у этого контингента рост коринебактерий может быть угнетен другими бактериями.
Тесты на определение вирулентности. Каждый изолят коринебактерий дифтерии следует исследовать на вирулентность и токсигенность для полной бактериологической диагностики. Тесты на определение вирулентности можно проводить методами in vivo (подкожное и внутрикожное введение животным) и in vitro (реакция преципитации и тест в культурах тканей).
Подкожное введение. Культуру коринебактерий, которая выросла после 12-часовой инкубации на свернутой сыворотке Леффлера, растворяют в 2-4 мл бульона и вводят подкожно 0,8 мл эмульсии двум мор-ским свинкам, одной из которых за 18-24 часа до этого ввели 500 единиц дифтерийного антитоксина. Если штамм является вирулентным, то неиммунизированное животное гибнет через 4 часа; при его вскрытии вы-являют все симптомы, перечисленные в подразделе “Патогенность для животных” этого параграфа. Этот тест уже не используют в связи с изменениями правил работы с лабораторными животными.
Внутрикожное введение. Бульонную эмульсию культуры вводят внутрикожно двум морским свинкам (или кроликам) по 0,1 мл в два различных места каждой. Одно животное служит контролем, ему за день до эксперимента вводят 500 единиц антитоксина. Другому животному вводят внутрибрюшинно 50 единиц антитоксина через 4 часа после внутрикожного введения. Токсигенность оценивают по воспалительной реакции, которая прогрессирует до некроза через 48-72 часа у опытного животного, у контрольного животного изменений не происходит. Преимуществом этого теста является то, что животные не умирают. На одном кролике можно протестировать 10 штаммов.
Реакция преципитации Элека. Прямоугольную полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифте-рийным антитоксином (1000 единиц в 1 мл) помещают на поверхность чашки Петри с агаром, который со-держит 20 % сыворотки крови лошадей; когда агар ещё жидкий. Вместо лошадиной сыворотки можно ис-пользовать сыворотку овец или кроликов. После эту поверхность подсушивают и делают узкие посевы штаммов под прямыми углами к полоскам фильтровальной бумаги. Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Токсины, которые продуцируются бактериями во время их роста, растворяются в агаре и при контакте с антитоксином в оптимальной концентрации проявляется линия преципитации. Наличие таких линий преципитации (в виде головок стрелок) является доказательством токсигенности штамма, отсутствие - наоборот. Этот тест очень удобен и экономен, но следует помнить, что некоторые пептоны и сыворотки непригодны для использования.
Тест в культурах тканей. Токсигенность дифтерийных коринебактерий можно продемонстрировать путём нанесения штаммов в агаре на монослой клеточных культур. Токсин, который продуцируют бактерии, диффундирует в клетки и разрушает их.
Описано около 15 типов бактериофагов. Типы I и III - это mitis, IV и VI - intermedius, VИИ - невиру-лентный gravis, а другие - вирулентные gravis. Фаготипы являются относительно стабильными. В лабораторной диагностике используют бактериоцины (дифтерицины), молекулярно-генетический метод.
5.2. Материал для самоподготовки
Вопросы для самоподготовки врачей-курсантов:
-
Род коринебактерий, морфология, культуральные и биохимические свойства. -
Классификация и дифференциация типов коринебактерий. -
Механизм заражения, патогенез для человека. -
Лабораторная диагностика дифтерии. -
Клинические формы заболевания. -
Патогенез дифтерии, роль токсинов и ферментов в патогенности.
7. Методика постановки РНГА для расчета наличия антитоксического иммунитета.
8. Специфическая и неспецифическая профилактика дифтерии.
9. Лечение. Схема применения антитоксической противодифтерийной сыворотки.
Тесты для самоподготовки:
-
Тест № 1. У больного дифтерией ребенка через 10 дней после введения антитоксической противодифтерийной сыворотки, появились высыпания на коже, которые сопровождались сильным зудом, повысилась температура тела до 38, появились боли в суставах. Какую причину этих явлений Вы предполагаете? -
1) Анафилактическая реакция -
2) Атопия -
3) Сывороточная болезнь* -
4) Гиперчувствительность замедленного типа -
5) Контактная аллергия. -
Тест № 2. В больницу поступил ребенок с диагнозом дифтерия. Какими препаратами для специфической терапии Вы воспользуетесь? -
1) Дифтерийным анатоксином, антибиотиками -
2) Вакциной “Кодивак”, сульфаниламидами -
3) Противодифтерийной антитоксической сывороткой, антибиотиками* -
4) Дифтерийными вакцинами: АКДС, АДС, АД -
5) Дифтерийным бактериофагом. -
Тест № 3. При микроскопии мазка, приготовленного из исследуемого материала от больного ребенка с подозрением на дифтерию и окрашенного по Нейссеру, обнаружены палочки светло-коричневого цвета с темно-синими включениями на концах. Какой структурный элемент микробной клетки выявлен? -
1) Споры -
2) Капсула -
3) Зерна волютина* -
4) Жгутики -
5) Ядерная субстанция. -
Тест № 4. У ребенка с подозрением на дифтерию из зева выделена чистая культура микроорганизмов и изучены их морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства, оказавшиеся типичными для возбудителей дифтерии. Какое исследование необходимо еще провести для выдачи заключения о том, что выделена патогенная дифтерийная палочка? -
1) Определение токсигенных свойств* -
2) Определение протеолитических свойств -
3) Определение уреазной активности -
4) Определение цистиназной активности -
5) Определение способности расщеплять крахмал.
-
Практическая часть для самоподготовки: -
1. Изучение морфологии и ферментативных свойств возбудителей дифтерии. Промикроскопируйте и зарисуйте окрашенные по Граму мазки из зева людей с подозрением на дифтерию. -
2. Произведите посев материала на среды для получения изолированных колоний. Запишите в рабочую тетрадь проделанную работу. -
3. Оценить ферментативную активность коринебактерий на среде Ресселя, пестрому ряду Гисса. -
4. Учесть чувствительность к антибиотикам. -
5. Учесть реакцию РНГА для определения антитоксического иммунитета. -
6. Исследование чистой культуры коринебактерий на токсигенность. Запишите предварительный ответ в графу «Результат».