Файл: Отчет по практике вид (тип) практики Преддипломная практика Курс (группа).docx

Вторая реакция не очень специфична, но весьма чувствительна. Поэтому метод Лоури позволяет вести определения белков в сильно разбавленных растворах.

Таблица 2. Данные для построения градуировочного графика

№ пр.	Сбелка, мкг/мл	А1	А2	А3	Аср
1	10	0,074	0,076	0,077	0,076
2	40	0,212	0,211	0,208	0,210
3	100	0,490	0,494	0,497	0,494
4	160	0,684	0,686	0,695	0,688
5	200	0,811	0,818	0,828	0,819

y = 0,0039x+0,06

R² = 0,9923


Рисунок 3. Градуировочный график по методу Лоури

Полученная зависимость была обработана в координатах линейного уравнения:

y = a∙x + y₀

Таблица 3. Параметры уравнения для градуировочного графика

Параметр	Значение	Доверительный интервал
a, см3/мкг	0,0039	0,0002
y0	0,06	0,03

3.2.1. Количественное определение белка в растворенном осадке после высаливания 35% от насыщения сульфата аммония

Таблица 4. Данные измерения оптической плотности в растворенном осадке после высаливания 35% и его концентрация

А	Концентрация (X), мкг/мл		Доверительный интервал (δX)	Концентрация , мкг/мл
0,186	32,31	32,05	0,7	32,1±0,7
0,185	32,05
0,184	31,79

---

0,186 = 0,0039x + 0,06; x = 32,31 мкг/мл

0,185 = 0,0039x + 0,06; x = 32,05 мкг/мл

0,184 = 0,0039x + 0,06; x = 31,79 мкг/мл

Разбавление в 200 раз

x = 32,1∙200 = 6420 мкг/мл; x = 6,42 мг/мл

3.2.2. Количественное определение белка в растворенном осадке после высаливания 70% от насыщения сульфата аммония

Таблица 5. Данные измерения оптической плотности в растворенном осадке после высаливания 70% и его концентрация

А	Концентрация (X), мкг/мл		Доверительный интервал (δX)	Концентрация , мкг/мл
0,455	101,28	102,04	3	102±3
0,456	101,54
0,463	103,3

0,455 = 0,0039x + 0,06; x = 101,28мкг/мл

0,456 = 0,0039x + 0,06; x = 101,54 мкг/мл

0,463 = 0,0039x + 0,06; x = 103,3 мкг/мл

Разбавление в 200 раз

x = 102∙200 = 20400 мкг/мл; x = 20,04 мг/мл

3.2.3. Количественное определение белка после концентрирования в растворенном осадке после высаливания 35% отнасыщения

Таблица 6. Данные измерения оптической плотности в растворенном осадке после высаливания 35% и его концентрация

Таблица 6. Параметры уравнения для градуировочного графика

Параметр	Значение	Доверительный интервал
a, см3/мкг	0,0020	0,0003
y0	-0,01	0,04

Таблица 7. Данные измерения оптической плотности в растворенном осадке после высаливания 35% и его концентрация

А	Концентрация (X), мкг/мл		Доверительный интервал (δX)	Концентрация , мкг/мл
0,138	70,48	70,63	2	71±2
0,140	71,43
0,137	70

---

0,138 = 0,002x - 0,01; x = 70,48 мкг/мл

0,140 = 0,002x - 0,01; x = 71,43 мкг/мл

0,137 = 0,002x - 0,01; x = 70,00 мкг/мл

Разбавление в 200 раз

x = 71∙200 = 14200 мкг/мл; x = 14,2 мг/мл

3.2.4. Количественное определение белка после концентрирования в растворенном осадке после высаливания 70% отнасыщения

Таблица 8. Данные измерения оптической плотности в растворенном осадке после высаливания 70% и его концентрация

А	Концентрация (X), мкг/мл		Доверительный интервал (δX)	Концентрация , мкг/мл
0,470	228,57	238,10	21	238±21
0,500	242,86
0,500	242,86

0,470 = 0,0020x - 0,01; x = 228,57 мкг/мл

0,500 = 0,0020x - 0,01; x = 242,86 мкг/мл

0,500 = 0,0020x - 0,01; x = 242,86 мкг/мл

Разбавление в 200 раз

x = 238∙200 = 47600 мкг/мл; x = 47,6 мг/мл

3.3. Концентрирование фермента

Концентрирование проводили на концентрирующих фильтрах 10 кДа, центрифугировали при 5000 об/мин. Концентрация фермента после концентрирования в фракции после 35% высаливания увеличилась примерно в 2,2 раза, а концентрация в фракции после 70% высаливания увеличилась примерно в 2,4 раза.

Выводы

1. 
   Провели ступенчатое разделение белков из гомогенизированных тканей корней Armoracia Rusticana. Получено 2 осажденых белковых фракции с суммарным содержанием 32,1±0,7 мкг/мл в высаливание 35% от насыщения сульфата аммония и 102±3 мкг/мл в высаливание 70% от насыщения сульфата аммония;
   
2. 
   Концентрирование проводили на фильтрах 10 кДа. Провели концентрирование фермента в 2 осажденных белковых фракциях с суммарным содержанием 71±2 мкг/мл в высаливание 35% от насыщения сульфата аммония и 238±21 мкг/мл в высаливание 70% от насыщения сульфата аммония;
   

Список литературы

1. 
   Banci L. Structural properties of peroxidases //Journal of biotechnology. – 1997. – Т. 53. – №. 2-3. – С. 253-263.
   
2. 
   Захарова Г. С., Упоров И. В., Тишков В. И. Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств химической модификацией белковой глобулы и гемма //Успехи биологической химии. – 2011. – Т. 51. – С. 37-64.
   
3. 
   Wuhrer M. et al. New features of site-specific horseradish peroxidase (HRP) glycosylation uncovered by nano-LC-MS with repeated ion-isolation/fragmentation cycles //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. – 2005. – Т. 1723. – №. 1-3. – С. 229-239.
   
4. 
   Veitch N. C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme //Phytochemistry. – 2004. – Т. 65. – №. 3. – С. 249-259.
   
5. 
   Pandey V. P. et al. A comprehensive review on function and application of plant peroxidases //Biochem Anal Biochem. – 2017. – Т. 6. – №. 1. – С. 308.
   
6. 
   Mao L. et al. Horseradish peroxidase inactivation: heme destruction and influence of polyethylene glycol //Scientific Reports. – 2013. – Т. 3. – №. 1. – С. 1-7.
   
7. 
   Arnao M. B. et al. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology. – 1990. – Т. 1038. – №. 1. – С. 85-89.
   
8. 
   Amao, M. В.; Acosta, M.; Del Rio, J. A.; Garcia-Canovas, F. //Inactivation of Peroxidase by Hydrogen Peroxide and Its Protection by a Reductant Agent. Biochim. Biophys. Acta 1990,1038, pp: 85-89.
   
9. 
   Amao, M. В.; Acosta, M.; Del Rio, J. A.; Varon, R.; Garcia-Canovas, F. //A Kinetic Study on the Suicide Inactivation of Peroxidase by Peroxide. Biochim. Biophys. Acta 1990,1041, pp: 43-47.
   
10. 
    Полозников А. А. и др. Способ получения пероксидазы из корней хрена. – 2013.
    
11. 
    Преснова Г. В., Рубцова М. Ю., Егоров А. М. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена //Российский химический журнал. – 2008. – Т. 52. – №. 2. – С. 60-65.
    
12. 
    Ferapontova E. E. et al. Mediatorless biosensor for H2O2 based on recombinant forms of horseradish peroxidase directly adsorbed on polycrystalline gold //Biosensors and Bioelectronics. – 2001. – Т. 16. – №. 3. – С. 147-157.
    
13. 
    Ferri T., Poscia A., Santucci R. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase.: Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide //Bioelectrochemistry and bioenergetics. – 1998. – Т. 45. – №. 2. – С. 221-226.
    
14. 
    Malhotra B. D., Chaubey A. Biosensors for clinical diagnostics industry //Sensors and Actuators B: Chemical. – 2003. – Т. 91. – №. 1-3. – С. 117-127.
    
15. 
    Полыгалина Г. В., Чередниченко В. С., Римарева Л. В. Определение активности ферментов. – 2003.
    

---

---