Файл: Отчет по практике вид (тип) практики Преддипломная практика Курс (группа).docx

Cорбция/окклюзия полимерными продуктами (т.е. HRP адсорбируется на осажденных продуктах соединения, и его активные центры закупориваются);
Разрушение гема (т.е. сильные реагенты, образующиеся в ходе ферментативной реакции, такие как свободные радикалы, вступают в реакцию с гемовым центром в HRP и инактивируют его) [6].

1.5. Методы выделения пероксидазы хрена

Известен способ выделения пероксидазы из корней хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента солевым раствором, осаждение фермента солями сульфата аммония, гельфильтрацию, спиртовое осаждение, электрофорез, переосаждение хлоридом аммония, фильтрацию через сефадекс G-50 и ДЭАЭ-целлюлозу, и диализ. Основными недостатками данного способа являются невысокая активность и чистота полученного продукта, а также сложность его получения и большое количество стадий технологического процесса [10].

Известен метод, по которому корни хрена проращивают в течение 2-3 суток, затем гомогенизируют и экстрагируют водой в течение суток. Водный экстракт центрифугируют с последующим фракционированием белков солями сульфата аммония, после чего сульфатаммонийный осадок фермента растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации на фильтрах "Милипор". К полученному фильтрату прибавляют 0,5 М фосфатный буфер (рН 8) в соотношении 100 частей буфера на 1 часть фильтрата и пропускают через колонку с ионообменником ДЭАЭ-Сефадекс А-50, затем последовательно ультрафильтруют на "Милипор" и подвергают лиофильной сушке. Недостатком данного метода является недостаточно высокий выход пероксидазы, высокая трудоемкость и длительность процесса [10].

Известен метод выделения пероксидазы из корней хрена, по которому корни хрена гомогенизируют, затем экстрагируют фермент водой и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония с последующей гельфильтрацией. Недостатком данного способа является низкий выход и низкая чистота фермента [10].

Известен также метод получения пероксидазы, включающий гомогенизацию растительной ткани хрена, экстракцию фермента, отделение экстракта с проведением осаждения фермента сульфатом аммония, очистку фермента концентрированием ультрафильтрацией и гельфильтрацией, последующую лиофилизацию целевого продукта, причем в качестве растительной ткани хрена используют отходы от зачистки корней при производстве пищевой продукции, перед ультрафильтрацией в экстракт вносят сульфит натрия в эффективном количестве, осаждают фермент сульфатом аммония из ультрафильтрата, а после гель-фильтрации фермент дополнительно очищают ионообменной хроматографией [10].

1.6. Применение пероксидазы хрена

1.6.1. Биосенсоры на основе пероксидазы хрена

Биосенсоры с иммобилизованной пероксидазой хрена могут быть использованы в первую очередь для определения субстрата пероксидазы – пероксида водорода. Эта задача весьма актуальна: существует потребность в анализах биологических жидкостей и других растворов для определения пероксида водорода вследствие его ключевой роли в различных процессах, протекающих в человеческом организме и в окружающей среде [11].

Самый простой электрод для обнаружения H₂O₂ представляет собой монослой молекул HRP, адсорбированных на поверхности электрода. При подаче правильного потенциала на модифицированный HRP электрод, зарегистрированный ток восстановления будет пропорционален концентрации перекиси или других пероксидов. В комбинации с оксидазами, катализирующими реакции получения Н₂О₂, они детектируют субстраты оксидаз [12].

Пероксидаза катализирует окисление различных электродонорных субстратов по следующей схеме:

HRP + H₂O₂  Соединение I + H₂O (1)

Соединение I + AH₂  Соединение II + AH• (2)

Соединение II + AH₂  HRP + AH• (3)

Где Соединение I и Соединение II являются окисленными промежуточными соединениями пероксидазы, АН₂ и АН• являются электронодонорным субстратом и радикальным продуктом одноэлектронного окисления соответственно.

Если фермент иммобилизован на электроде, то последний может выступать в качестве электронодонорного субстрата (АН₂) в общем цикле пероксидазной реакции. Этот процесс рассматривается как прямой электронный перенос. Пероксидаза хрена окисляется пероксидом водорода в соответствии с реакцией (1), и затем последовательно восстанавливается электронами, которые обеспечивает электрод:

Соединение I +2e̅ +2H⁺ → HRP + H₂O (4)

Пероксидазные биосенсоры, основанные на прямом электронном переносе, могут быть использованы для обнаружения пероксида водорода и небольших органических гидропероксидов. В соединении с оксидазами, производящими пероксид водорода, они также могут быть использованы для определения концентрации субстратов оксидаз, таких как глюкоза, спирты, глютамин, холин [13].

Первая реакция включает двухэлектронное окисление простетической группы пероксидазы перекисью. Эта биоэлектрокаталитическая реакция восстановления Н₂О₂ в отсутствие медиатора наблюдалась для ПХ, адсорбированной на угле и графите

, золоте и платине. При этом константа скорости для (4) реакции, как правило, не превышала 1с^-1 [12]. Это обуславливается тем, что активный центр пероксидазы расположен достаточно глубоко в гидрофобном кармане ее глобулы и расстояние для переноса электрона слишком велико и, гликозилированные остатки на поверхности пероксидазы могут действовать как изолятор и затруднять электронный перенос между активным центром этого фермента и электродом [11].

1.6.2. Иммунобиосенсоры с пероксидазой хрена в качестве метки

Пероксидаза применяется в качестве метки одного из биокомпонентов в биосенсорах, основанных на принципах иммунохимического распознавания. В этих биосенсорах осуществляется реакция антиген–антитело, что существенно улучшает специфичность распознавания определяемого вещества в образцах сложного состава, а использование фермента значительно повышает чувствительность метода. Благодаря относительно невысокой стоимости пероксидазы в сравнении с флуоресцентными или радиоактивными метками, биосенсоры с пероксидазой в качестве метки получили широкое распространение.

Иммуносенсоры имеют преимущество при выполнении анализов, когда требуется высокая чувствительность определения. Это необходимо в медицинской практике для диагностики различных биологически активных соединений, для контроля качества продуктов питания, экологического контроля объектов окружающей среды на наличие остаточных количеств загрязнителей и токсикантов. Иммуносенсоры особенно перспективны для проведения медицинских исследований, так как они обеспечивают необходимую чувствительность и специфичность при анализе сложных по составу биологических жидкостей. Недостаточно широкое внедрение био- и иммуносенсоров в медицинскую практику связано с тем, что они не позволяют, как правило, определять несколько соединений одновременно [14].

1.6.3. ДНК-сенсоры с пероксидазой хрена в качестве метки

Разработаны биосенсоры, основанные на использовании ДНК или олигонуклеотидов в качестве биораспознающих реагентов и пероксидазы хрена в качестве метки. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. При этом зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью, затем последовательно добавляют авидин или стрептавидин и биотинилированный фермент, в качестве которого может быть использована пероксидаза хрена. Альтернативой может служить конъюгат пероксидазы со стрептавидином, имеющим сайт связывания с биотином.

Так же есть весьма перспективный ДНК-сенсорный метод, чувствительность которого к ДНК может быть повышена путем введения в процесс анализа дополнительных молекул метки – биотина. Как и в предыдущем методе, проводится гибридизация ДНК, меченной биотином, затем связывание биотина на поверхности с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза. Метод усиления аналитического сигнала основан на способности пероксидазы окислять производные тирамина с образованием промежуточных высокоактивных радикальных частиц, которые затем могут ковалентно связываться с поверхностью белковой глобулы фермента в непосредственной близости от активного центра фермента – источника их образования. Радикальные частицы, иммобилизованные на поверхности вблизи фермента, могут быть также выявлены конъюгатом стрептавидин-пероксидаза. Таким образом, на поверхность вводятся дополнительные молекулы пероксидазы, что обеспечивает расширение диапазона аналитического сигнала [11].

2. Экспериментальная часть

2.1. Выделение пероксидазы хрена

162 г. промытых корней хрена гомогенизируют при помощи блендера, терки или мясорубки, с сохранением соков и заливают 162 см³ фосфатного буферного раствора pH=7,6. Экстракцию ведут в течение часа.
Экстракт отделают декантацией и выдерживают сутки в холодильнике. Потом фильтруют через марлю и затем через бумажный фильтр красная лента.
Проводят высаливание при помощи (NH₄)₂SO₄, 0-35% от объема, затем 35-70%. После каждого высаливание проводят центрифугирование 10000 об/10 мин, надосадочную жидкость сливают в колбу, а осадок растворяют буферным раствором в объеме 10 см³ и переносят в пробирку с пробкой. Для анализа используют осадок после 70% и 35% высаливания.
Для концентрирования использовали концентрирующие фильтры 10 кДа.

2.2. Определение концентрации фермента

Количественное определение содержания фермента проводили по методу Лоури.

Перед определением смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива В (раствор С), реактив Фолина разбавляют в 2 раза.

Перед определением строят градуровочный график. Для построения градуировочного графика применяют стандартный раствор белка БСА с концентрацией 200 мкг/мл, готовят растворы белка с разной концентрацией, как показано в таблице.

Таблица 1. Данные для приготовления градуировочных растворов

№ пр.	станд. 200 мкг/мл раствор БСА, мл	Дистиллиро-ванная вода, мл	Концентрация белка, мкг/мл	Содержание белка в пробе, мкг
р-р сравнения	-	1,00	0	0
1	0,05	0,95	10	10
2	0,20	0,80	40	40
3	0,50	0,50	100	100
4	0,80	0,20	160	160
5	1,00	-	200	200

Одновременно ставят пробирку с пробой неизвестной концентрации. В каждую пробирку добавляют 5 мл реактива С, перемешивают. Через 10 минут добавляют 0,5 мл разведенного в 2 раза реактива Фолина тщательно перемешивают и помещают в термостат при 37ºС на 30 минут для развития окраски. Фотометрируют на фотометре при длине волны 700 нм.

По результатам измерений строят градуировочный график с использованием компьютерных программ (Microsoft Exel или SigmaPlot) и определяют содержание белка в неизвестной пробе.

3. Результаты и их обсуждения

3.1. Выделение и концентрирование пероксидазы хрена

162 грамма промытых водой корней хрена гомогенизируют при помощи блендера, терки или мясорубки, с сохранением соков и заливают 162 см³ фосфатного буферного раствора pH=7,6. Экстракцию ведут в течение часа.
Экстракт отделают декантацией и выдерживают сутки в холодильнике. Потом фильтруют через марлю и затем через бумажный фильтр. В результате декантации и фильтрации общий объем раствора получился 100 см³.
Для осаждения выделенных белков полученный раствор подвергают ступенчатому высаливание при помощи (NH₄)₂SO₄, 0-35% от объема, затем 35-70%. После каждого высаливание проводят центрифугирование 10000 об/10 мин, надосадочную жидкость сливают в колбу, а осадок растворяют буферным раствором в объеме 10 см³ и переносят в пробирку с пробкой. После 35% высаливания объем надосадочной жидкости составил 102 см³. После 70% высаливания объем надосадочной жидкости составил 98 см³. Для анализа используют осадок после 35% и 70% высаливания.
Концентрирование фермента проводят на концентрирующих фильтрах 10 кДа, в фильтры заливают исследуемые образцы (растворенные осадки после 35% и 70% высаливания разбавленные в 2 раза) и центрифугируют при 5000 об/10 мин, после каждого центрифугирования раствор прошедшею через фильтр выливают, а к раствору, оставшемуся на фильтре приливают новую партию фермента до тех пор, пока раствор не перестанет проходить через фильтр.

3.2. Количественное определение белка

Метод Лоури основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором одновременно осуществляются, по меньшей мере, две цветные реакции на белок: биуретовая реакция и реакция Фолина с тирозиновыми и цистеиновыми радикалами белковой молекулы. Последняя состоит в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот с образованием комплексного соединения синего цвета. Полагают, что в реакциях восстановления принимают участие комплексные соединения меди, возникшие при взаимодействии белка с щелочным раствором медного купороса.