Компоненты питательной среды

1. макроэлементы

2. микроэлементы

3. источники железа

4. органические добавки – витамины. Большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах (их надо добавлять дополнительно, особенно группы В).

5. источники углерода (т.к. даже зеленеющие ткани не аутотрофны). Лучший источник – сахароза.

6. органические добавки – регуляторы роста растений – ауксины и цитокинины (играют роль пусковых механизмов).

Существует несколько стандартных питательных сред, широко используемых при культивировании, но количество регуляторов роста в них варьирует исходя из вида растений.

Концентрации различных компонентов среды могут влиять на выход продукта.

Пример: в культуре клеток барвинка розового увеличение выхода алкалоидов было связано с увеличением в среде концентрации сахарозы.

Пример: в культуре клеток моркови накопление антоциана стабилизировалось, когда в качестве лимитирующего фактора использовали фосфаты.

Культуру клеток получают:

• на поверхности твердой питательной среды (твердофазная ферментация);

Обычно используется для первичного получения культур клеток, их оценки в качестве возможных продуцентов БАВ и для выращивания посевного материала.

• в виде суспензии в жидкой питательной среде (глубинное суспензионное культивирование).

Преимущества и недостатки каллусных культур

Преимущества каллусных культур в технологии получения растительного сырья:

• надежность и стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма;

• возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации

Недостаток: в необходимости применения ручного труда.

При производстве настоек женьшеня, плантационное выращивание этой культуры в количественном отношении по выходупанаксозидовимеет преимущество перед каллусным сырьем, но по токсичности препараты, получаемые из каллусного сырья, менее опасны.

---

СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Суспензионные культуры – отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Сосуды с суспензией клеток помещаются на качалки, скорость перемешивания 100 - 120 об/мин (так обеспечивается аэрация и клеточные агрегаты распадаются на отдельные фрагменты).

Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, но растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования.

Особенности растительных клеток

• наличие целлюлозной клеточной оболочки;

• низкая интенсивность дыхания (по сравнению с микроорганизмами). Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. А углекислый газ может существенно влиять на длину лаг-фазы.

• клетки растений в 50-100 раз больше, чем клетки бактерий и грибов;

• в результате роста клетки увеличиваются в размерах, в них появляется большая вакуоль;

Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания (иначе оседание клеток приведет к появлению «мертвых зон», в которых происходит быстрое накопление и старение клеток). Важна устойчивость штамма к механическому стрессу.

Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха. Однако при этом в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток (изучено для микробов, для растений – нет).

---

• суспензионные культуры состоят из клеточных агрегатов (для роста клеткам растений необходима высокая плотность);

В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются (адгезия) и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели. 

• клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время их удвоения: 1-3 суток.

Преимущества глубинного культивированияперед твердофазным способом:

• автоматически поддерживаются все необходимые параметры;

• постоянный контроль содержания в питательной среде основных элементов питания;

• постоянный микробиологический контроль с целью предотвращения инфицирования и гибели культур;

• контроль активности роста и деления клеток;

• контроль образования БАВ;

• получение большой биомассы.

Выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах, но управлять процессом культивирования легче при работе в суспензионных культурах. Выращивание культур в биореакторах глубинным способом дает получение большой биомассы.

Факторы, от которых зависит накопление вторичных метаболитов в культуре клеток

Для индукции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в клеточных популяциях. Важнейшим условием морфогенеза является адгезия клеток (соединение клеток между собой), в результате которой образуется ткань и орган. Поэтому важна гравитация.

1. Регуляторы роста растений

При изменении условий культивирования можно вызвать вторичную дифференциацию и получить целое растение. Решающую роль в этом играет соотношение фитогормонов и их концентрация в питательной среде.

Скуг и Мурасиге – концепция, согласно которой можно получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов.

• ауксины (индолил-3-уксусная кислота (ИУК), нафтилукссная кислота (НУК) и 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д))

Ауксин

---

активирует деление и растяжение клеток. Проникая в клетки, ауксины связываются со специфическими рецепторами, в клеточной мембране индуцируют работу протонного насоса (помпы) в результате матрикс клеточных стенок размягчается (необходимое условия для роста и растяжение клеточных стенок). Усиливается секреция кислых гидролаз и полисахаридов, необходимых для дальнейшего роста клеточных стенок. Уменьшается продолжительность митоза. Предварительное усиление синтеза и накопления РНК. Стимуляция синтеза белка и появление новых белков. Усиление активности митохондрий.

• цитокинины– 6-бензиламинопурин (БАП), N-изоптен и 6-фурфуриламинопурин (кинетин) – регулируют деление клеток, морфогенез побега и корня, созревание хлоропластов, образование почек и старение.

2. Внесение в питательную среду предшественников

Пример: внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток диоскореи увеличивает выход диосгенина на 100%. Диосгенин используют для производства гормональных препаратов, таких как кортизон и прогестерон

3. Физические факторы

Накопление вторичных метаболитов зависит от света, температуры, рН, а при суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости вращения сосудов, от газового состава и т.д.

Дифференцировка клеток

Синтез вторичных метаболитов коррелирует с процессом дифференцировки в культуре клеток. Синтез вторичных метаболитов в культуре клеток связан с внутриклеточными органеллами – пластидами и эндоплазматическим ретикулумом. Стабильность синтеза зависит от стадии культивирования и дифференцировки клеток.

Пример 1: в суспензионной культуре мака снотворного (Papaver somniferum) синтез алкалоидов начинается только после того, как в ней дифференцируется достаточно большое количество специализированных клеток млечников, предназначенных для депонирования метаболитов.

Пример 2: дифференцированные корневые каллусы красавки обыкновенной синтезируют тропановые алкалоиды, а недифференциорованные – нет.

Но Пример 3: Культуры клеток табака и моркови синтезируют большое количество никотина и антоциана при слабой дифференцировке клеток.

Пример 4

---

: Выход алкалоидов раувольфии наблюдается при использовании недифференцированных клеток.

Связь между ростом и метаболизмом – два типа механизма:

• прямая связь – рост определяет степень агрегации клеток, оказывая косвенное влияние на синтез вторичных метаболитов. Достаточная степень агрегации может быть получена только в медленно растущих культурах.

• обратная связь – определяющим фактором является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и вторичные пути метаболизма по разному конкурируют за предшественник в быстро и медленно растущих клетках. Если условия среды благоприятны для быстрого роста, то в первую очередь синтезируются первичные метаболиты. Если быстрый рост блокирован, то начинается синтез вторичных метаболитов. Таким образом, низкая скорость роста иммобилизованных клеток способствует высокому выходу метаболитов.

Проблема

За исключением некоторых видов растений, суспензионные и каллусные культуры клеток синтезируют вторичные метаболиты в меньших количествах, чем целые растения. При этом рост биомассы в ферментере может быть значительным.

Повысить выход целевого продукта можно с помощью иммобилизации.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ

Иммобилизованные клетки образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах, но они способны к интенсивной выработке метаболитов. Одно из условий при иммобилизации клеток – выделение метаболита в питательную среду, из которой он должна быть легко извлечен (например, алкалоиды).

Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами:

• многократное использование

• четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма

• увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования

• получение большого количества вторичных метаболитов

• клетки растут в тесном физическом контакте друг другом, что благоприятно отражается и на химических контактах.

Биотрансформация

Биотрансформация – метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения и способные менять функциональные группы добавленных из вне химических соединений.

---

Смотрите также файлы

• Конкурс это. Выберите один правильный ответ.docx

• 20 " " 5 сыныпа арналан трбие жоспары.docx

• Бизнес в законе 1 2007 154 правовое обеспечение.pdf

• Методические указания по выполнению лабораторных работ дисциплины Физические основы электроники.rtf

• Питер Нортон.docx