ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.07.2024
Просмотров: 398
Скачиваний: 0
ношение (приблизительно). Например, если движется около 60% спермиев, прямолинейно-поступательное – это 6 баллов. Иногда движущиеся в одном направлении спермии образуют поток или струю, порождающую завихрения, что легко спутать с манежным движением, однако вихревые движения быстро исчезают. Для отработки навыков полезно вначале определить процент прямоли- нейно-поступательных спермиев, потом процент неподвижных, процент с манежным, процент с колебательным, затем результаты сложить и сумма должна быть 100%. Свои навыки полезно проверить, используя объективный способ определения активности.
Объективный способ – основан на точном подсчёте активных и неактивных спермиев с получением достоверного результата. При смешивании спермы с водным раствором эозина живые спермии с прямолинейно-поступательным движением (активные) не окрашиваются, а мертвые, ослабленные (с манежным и колебательным движением) имеют повышенную проницаемость для красителя и вследствие этого окрашиваются.
Техника приготовления препарата. На край предметного стекла (обезжиренного) пипеткой или стеклянной палочкой наносят небольшую каплю спермы и 2-3 капли 5%-го водного раствора эозина. Капли быстро перемешивают и из смеси делают тонкий мазок спермы. Мазок быстро высыхает на воздухе (1 мин считается нормой, если больше – мазок толстый).
Определение активности. Под микроскопом при увеличении в 400-600 раз в нескольких полях зрения подсчитывают подряд 500 неокрашенных (живых, активных) спермиев и окрашенных (мертвых, ослабленных) отдельно учитывая количество неокрашенных.
Полученный процент живых спермиев выражает активность спермиев в баллах.
Для окончательного подсчета используют формулу
Ж 100 , %, 500
где П – процент живых спермиев; Ж – число живых (неокрашенных) спермиев.
Однако данный способ оценки активности спермы довольно трудоёмкий, продолжительный и не получил широкого распространения в производстве.
Для разбавления и хранения допускают густую сперму быка,
49
барана, густую или среднюю по густоте сперму хряка и жеребца. Редкая сперма непригодна для искусственного осеменения и бракуется. Необходимо также запомнить минимально допустимые нормы активности спермиев (показатели нормокинеспермии):
а) для разбавления и хранения:
свежее семя быка не ниже – 8 баллов;
свежее семя барана не ниже – 8 баллов;
свежее семя хряка не ниже – 7 баллов;
свежее семя жеребца не ниже – 5 баллов;
свежее семя петуха не ниже – 7 баллов;
б) для искусственного осеменения после хранения при температуре тающего льда (2-5оС):
семя быка активность не ниже – 7 баллов;
семя барана активность не ниже – 8 баллов;
семя жеребца активность не ниже – 5 баллов;
семя хряка активность не ниже – 6 баллов;
в) для искусственного осеменения после хранения при температуре -196оС в жидком азоте:
жеребца – 2 балла;
быка – 4 балла, если бык проверен по качеству потомства – 3 балла;
барана – 4 балла.
Вслучае отклонения показателей активности спермы следует указывать степень её нарушения. Олигокинеспермия – пониженная активность спермы, акинеспермия – отсутствие подвижности спермиев, некроспермия – содержание преимущественно мертвых спермиев.
Контрольные вопросы
1.При какой температуре следует проводить микроскопирование спермы?
2.Какую оценку имеет сперма в зависимости от насыщенности спермиями?
3.Что означает обозначение Г-7, С-6, Р-6?
4.Какие растворы нужно использовать при оценке спермы на актив-
ность?
5.Для чего используется столик Морозова при оценке спермы?
6.Какие виды движения спермиев вы знаете?
7.Что такое манежное движение?
50
8.При каком увеличении нужно м икроскопировать сперму?
9.Понятие об олигоспермии.
10.Какие существуют методики для определения активности сперм и-
ев?
11.Почему визуальная оценка активности спермы с помощью микр о- скопирования считается субъективной?
12.Как правильно приготовить препарат спермы в зависимости от вида животных?
13.Норма активности свежего семени у производителей сельскохо-
зяйственных животных.
14.Допустимая активность криоконсервированной спермы после ра з- мораживания.
15.Продолжительность оттаивания замороженной спермодозы.
16.Какая должна быть температура в водяной бане?
17.Почему спермии, имеющие прямолинейно -поступательное движе-
ние, не окрашиваются эозином?
Занятие 6. Определение концентрации спермиев с помощью счетной камеры Горяева
Цель занятия: изучить методику подсчета концентрации спермиев с помощью камеры Горяева.
Материал и оборудование: счетные камеры Горяева, эритроцитарные и лейкоцитарные смесители (меланжеры), покровные стекла, 3% раствор натрия хлорида, свежеполученная или размороженная сперма, спиртовые тампоны, резиновая груша, пробирки, часовое стекло, водяная баня, длинный анатомический пинцет, ножницы, ватные тампоны, марлевые салфетки, стеклянные градуированные пипетки.
Задание 1: определить концентрацию спермы.
Концентрация спермиев – это степень насыщенности спермы половыми клетками, которая выражается количеством спермиев в 1 мл спермы.
Определение густоты спермы путем глазомерной оценки не дает полного представления о количестве спермиев в эякуляте, кроме того, при определении густоты возможны большие ошибки. Знание концентрации спермиев необходимо, чтобы точно рассчитать, во сколько раз можно разбавить свежеполученную сперму и сколько самок можно осеменить одним эякулятом.
51
Концентрация спермиев, как и другие показатели, зависит от условий кормления, содержания, режима использования производителя, а также от индивидуальных особенностей (табл. 2).
Определение концентрации спермиев с помощью счетной камеры производят в следующей последовательности:
а) подготовка счетной камеры; б) разбавление спермы в смесителе или пробирке;
в) зарядка счетной камеры разбавленной спермой; г) подсчет количества спермиев в счетной камере;
д) вычисление концентрации спермиев в исследуемой сперме.
|
|
|
|
Таблица 2 |
Концентрация спермиев у производителей разных видов |
||||
Производитель |
Концентрация, млрд. в 1 мл |
|
||
минимально допустимая |
средняя |
|
максимальная |
|
|
|
|||
Баран |
2,0 |
2,5-3,5 |
|
8,0 |
Бык |
0,6 |
0,8-1,2 |
|
6,0 |
Жеребец |
0,05 |
0,1-0,15 |
|
0,8 |
Хряк |
0,1 |
0,15-0,2 |
|
1,0 |
Устройство и подготовка счетной камеры. Глубина камеры
0,1 мм, в одной сетке 25 больших квадратов по 5 в ряду, каждый разделен добавочными линиями на 16 малых квадратиков. Общая площадь сетки равна 9 мм2.
Все детали камеры перед сборкой следует обработать спиртовым тампоном и протереть марлевой салфеткой. Покровное стекло необходимо приложить к камере, прижать края стекла к боковым бровкам до появления радужных колец Ньютона. После фиксации стекла камера готова к заправке разбавленной спермой.
Разбавление спермы в смесителе. Разбавление спермы произ-
водят в специальном смесителе (меланжере) – стеклянной пипетке с пузырьковидным расширителем или пробирке с использованием 3% раствора натрия хлорида, обеспечивающего гибель половых клеток, следовательно, их неподвижность и возможность проведе-
ния подсчета. При разбавлении компоненты следует |
набирать |
|||||
в определённом соотношении (табл. 3). |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Таблица 3 |
|
Степень разбавления спермы |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
Сперма |
Смеситель |
Отметки, до которых набирают: |
|
Степень |
||
сперму |
|
3% р-р NаСl |
|
разбавления |
||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
Барана |
эритроцитный |
0,5 |
|
101 |
|
200 |
52
Быка |
эритроцитный |
1,0 |
101 |
100 |
Хряка, жеребца |
лейкоцитный |
0,5 |
11 |
20 |
Зарядка счетной камеры разбавленной спермой производится сразу же после перемешивания, если это сделать позже, то спермии начнут оседать, что приводит к грубым ошибкам при определении концентрации.
Первые четыре капли, не содержащие спермиев, из пипетки смесителя удаляют.
Методика подсчета. Спермии подсчитывают в 80 малых квадратиках, расположенных в 5 больших по диагонали. Порядок подсчета спермиев отражён на рисунке 7.
А |
Б |
Рис. 7. Сетка камеры Горяева:
А – сетка при малом увеличении; Б – сетка большого квадратика и траектория подсчёта спермиев (закрашенные клетки, учитываемые в первом квадратике)
Подсчет ведется по принципу буквы Г, так как другие стороны квадрата подсчитываются при возвращении. В малом квадратике подсчитываются все спермии, головки которых расположены
впросвете квадратика и на его верхней и левой боковой гранях.
Всоседнем квадратике используется тот же принцип, что исключает возможность повторного учёта одних и тех же спермиев и
гарантирует точность исследования.
Для получения более точных результатов в камере Горяева рекомендуют считать спермиев в двух сетках и при вычислении концентрации брать среднее из 2-х подсчетов (разница будет не больше 10%, если считать в трех сетках и брать два более подходящих результата).
53
Концентрацию спермиев определяют по формуле
С = |
N Д 400 |
, млрд./мл, |
|
|
|||
n p 1000000 |
|||
|
|
где С – концентрация спермиев;
N – число подсчитанных спермиев; Д – степень разбавления;
n – число малых квадратиков (80);
р – глубина счетной камеры (0,1 мм); 400 – множитель для пересчета на 1 мм2 (поскольку площадь
одного малого квадратика равна 1 мм2);
400
1000000 – число для перевода миллионов в 1 мм3 или в миллиарды в 1 мл (см3).
Существуют упрощенные формулы:
для быков – С = N ;
200
для баранов – С = N ;
100
для хряков, жеребцов – С = 1000N .
После окончания работы счетные камеры и стекла промывают вначале простой, а потом дистиллированной водой, и насухо вытирают марлевой салфеткой. Из смесителя удаляют остатки спермы и сразу же промывают их дистиллированной водой, затем спирт-эфиром. Высушивают смесители продуванием воздуха при помощи резиновой груши.
Определение концентрации спермиев в счетных камерах требует много времени. Поэтому на племпредприятиях используют специальные приборы.
Результаты исследований могут указывать на наличие патологических процессов, существенно влияющих на концентрацию спермиев в сперме. Так, если концентрация спермы окажется меньше физиологической нормы, то говорят об олигоспермии, если при подсчете не удалось обнаружить спермиев – аспермия.
54
Контрольные вопросы
1.Понятие о концентрации спермы.
2.Концентрация спермы у производителей разных видов.
3.Порядок определения концентрации с помощью камеры Горяева.
4.Степень разбавления спермы для подсчета у производителей разных видов.
5.Какой меланжер используют при определении концентрации спе р- мы быка?
6.Как готовят камеру Горяева?
7.Правила подсчета спермиев в камере Горяева.
8.Почему используют для разбавления спермы 3% раствор NаСl?
9.Формула определения концентрации у разных видов производите-
лей.
10. Почему разница при подсчетах не должна превышать 10%?
Занятие 7. Определение концентрации спермиев с помощью концентрационного фотоэлектроколориметра
(КФК) и оптических стандартов
Цель занятия: изучить методику работы с концентрационным фотоэлектроколориметром (КФК). Овладеть методикой построения калибровочной кривой и определения концентрации спермиев.
Материал и оборудование: прибор КФК, три кюветы с расстоянием между рабочими гранями 5 мм, чистые сухие пенициллиновые флаконы, пипетки градуированные на 0,1 мл или 0,2 мл, пипетка на 5 мл, 3,5% раствор цитрата натрия, сосуд на 0,5 л с дистиллированной водой, счетная камера Горяева, смесители (меланжеры) эритроцитарные и лейкоцитарные, покровные стекла, 96% этиловый спирт, эфир, 3% раствор натрия хлорида, резиновая груша, марлевые салфетки, спиртовые тампоны, свежеполученная сперма.
Задание 1:
1)ознакомиться с работой КФК и методикой определения концентрации спермиев;
2)построить калибровочную прямую.
Фотоэлектроколориметр – это прибор, работающий на основе фотоэлементов, которые преобразуют световой поток, проходящий через кювету с образцом разбавленной спермы, в электри-
55
ческую энергию (фотоэлементы цезиевые и селеновые).
Прибор необходимо включать за 20 мин до начала исследования для выделения полного светового спектра. Следует также открыть кюветное отделение, установить ручку светофильтра на красный фильтр.
Концентрационный фотоэлектроколориметр (КФК) – прибор, измеряющий интенсивность окраски или точнее – степень оптической плотность растворов.
Сущность методики определения концентрации спермиев с использованием этого прибора состоит в том, что пучок света определенной волны, пропущенный через кювету с разбавленной спермой, попадая на селеновые фотоэлементы, преобразуется в электрическую энергию, отклоняющую стрелку гальванометра, на котором отражены деления шкалы оптической плотности и коэффициента светопропускания. Отклонение стрелки напрямую зависит от величины электрического тока, проходящего через гальванометр, которая обратно пропорциональна мутности спермы.
При помощи этого прибора достаточно точно и быстро (1-2 мин) можно подсчитать концентрацию спермиев в сперме, тогда как с использованием счетной камеры Горяева для подсчета требуется 10-25 мин.
Предварительная настройка прибора заключается в установке стрелки прибора на ноль при прохождении пучка света через кювету с разбавителем, что делает данный раствор для прибора оптически прозрачным и малейшее присутствие спермиев в пробе будет менять оптическую плотность.
Для определения концентрации спермиев с помощью КФК необходимо, прежде всего, построить калибровочную (градуировочную) кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев. Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев высокая.
Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,0% раство-
ром лимоннокислого натрия 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:60, 1:80, 1:100, 1:120, 1: 140, 1:160, 1:180, 1:200, 1:220, 1:240, 1:260 (всего 15-20
разведений) готовят ряд образцов спермы и уточняют концентрацию спермиев в каждом из них по методике счетной камеры Горяева.
Затем определяют величину оптической плотности каждого
56