Файл: Практикум_по_акушерству_и_гинекологии.pdf

образца с помощью КФК. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строим калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси – известные концентрации, по вертикальной – соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения значений ставят точку. Калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а количество точек, лежащих выше и ниже проведенной кривой, было примерно одинаковым.

Имея калибровочную кривую (рис. 8) легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно определить его оптическую плотность на приборе, и установить, какой величине концентрации она соответствует по калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена калибровочная кривая.

Рис. 8. Калибровочная кривая для определения концентрации спермиев фотоэлектроколориметром

Надо использовать кюветы той же рабочей грани, красный светофильтр. Калибровочную кривую следует ежемесячно калибровать (уточнять), так как точность прибора изменяется (фотоэлементы теряют чувствительность). Для удобства определения концентрации спермиев можно пользоваться таблицами и коэффици- ентами-множителями, которые легко вывести из калибровочной

57

кривой.

Чтобы получить коэффициент-множитель, нужно среднеарифметическую концентрацию 15-20 образцов спермы разделить на соответствующую ей среднеарифметическую величину оптической плотности.

Имея коэффициент-множитель и зная величину оптической плотности эякулята, можно очень легко определить концентрацию спермиев, умножить первую величину на вторую.

Обычно коэффициент-множитель при соблюдении условий на КФК для спермы быка близок к двум, хотя для каждого прибора варьирует.

По точности данный метод не уступает методу подсчета в камере Горяева, величина ошибки ±6%. Метод фотоэлектроколометрии довольно прост по методике выполнения. Высокая чувствительность прибора требует исключительной аккуратности.

Ход работы следующий:

1)включают прибор в сеть за 20 мин до начала работы, открывают кюветное отделение, ручки настройки «грубо» и «точно» устанавливают в крайнее левое положение;

2)устанавливают красный светофильтр;

3) в кюветное отделение устанавливают кюветы с цитратом и кювету с семенем, разбавленным 3,5% раствором цитрата натрия в разведении: для быка – 1:200, барана – 1:400, хряка

ижеребца – 1:30;

4)закрывают кюветное отделение;

5)переключают рукоятку кюветного отделения на кювету с цитратом натрия;

6)устанавливают показания гальванометра по шкале оптической плотности на «0» ручками настройки «грубо» и «точно»;

7)переключают рукоятку кюветного отделения на кювету с семенем;

8)со шкалы оптической плотности считывают результат;

9)определяют концентрацию спермиев по калибровочной кри-

вой.

Погрешности в исследованиях могут быть обусловлены: грязными кюветами и предметами, имеющими контакт со спермой, неточность разбавления спермы перед исследованием, всевозмож-

ными механическими примесями в 3,5% растворе лимоннокислого натрия (непрофильтрованный), загрязнениями оптики прибора,

58

несвоевременностью исследования проб спермы. Поэтому кюветы со спермой после каждого исследования необходимо прополоскать дистиллированной водой не менее 3-х раз. Остатки воды убрать фильтровальной бумагой. Для исследования очередного образца брать другую кювету с такой же рабочей гранью. Кюветы брать только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие поверхности. Несмываемые загрязнения устраняют смесью эфира со спиртом. Для этого используют марлевые тампоны на деревянной палочке.

Задание 2: ознакомиться с методикой определения концентрации спермиев с помощью оптических стандартов.

Определение концентрации спермиев у быка и жеребца .

Для семени быка, жеребца потребуются оптические стандарты, которые представляют собой набор стеклянных ампул с жидкостью, имитирующей сперму разной степени мутности. На каждой ампуле имеется этикетка с указанием концентрации.

Методика определения. Берут пустую пробирку аналогичного диаметра и с такой же толщиной стенки, наливают 1 мл физраствора и добавляют 0,2 мл свежевзятой спермы быка (1:5), встряхивают и подбирают в проходящем свете ампулу с жидкостью, подходящей по мутности, на которой указана концентрация.

При определении концентрации спермы жеребца, сперму наливают в пробирку без разбавления, поскольку она имеет низкую концентрацию, в дальнейшем поступают также как у быков.

Определение концентрации спермиев у хряка. В 1974 г. вы-

пущен оптический стандарт для определения концентрации спермы хряков (автор Сердюк С.И.), в состав которого входят: 2 ампулы с концентрацией спермиев 5 млн. в 1 мл, пустые пробирки с такой же толщиной стенки и такого же диаметра – 8 шт., микропипетка на 0,1 мл – 1 шт., инструкция.

Методика определения. В пустую пробирку наливают 1 мл 1% раствора натрия хлорида добавляют 0,1 мл исследуемой спермы, встряхивают и смотрят в сравнении со стандартом на шрифт. Если шрифт не просматривается, добавляют еще 1 мл раствора, затем ещё 0,5 мл и т.д., до тех пор, пока шрифт не будет просматриваться одинаково.

Определяют концентрацию по формуле

59

К = 50 (П + 0,1),

где К – концентрация, млн./мл;

П– количество добавленного 1% раствора натрия хлорида

вмиллилитрах (мл);

50 – коэффициент.

Пример: для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме было добавлено всего 4,5 мл 1% раствора поваренной соли (с учетом раствора, ранее налитого в пустую пробирку)

К = 50 × (4,5 + 0,1) = 50 × 4,6 = 230 млн./мл.

Следовательно, в 1 мл исследуемой цельной спермы содержится 230 млн. спермиев.

Контрольные вопросы

1.Почему необходимо включать фотоэлектроколориметр за 20 мин до начала работы?

2.Степень разбавления спермы при работе с КФК.

3.Какой показатель мы получим по результатам работы на КФК?

4.С какой рабочей гранью используется кювета при работе с КФК?

5.Понятие о стандартах.

6.Требования, предъявляемые к светофильтрам и кюветам.

7.В какой кюветодержатель необходимо ставить кювету с семенем?

8.Во сколько раз необходимо разбавить сперму жеребца при определении концентрации с помощью стандартов?

9.Методика определения концентрации с помощью стандартов спермы быка и жеребца.

10. Определение концентрации спермы хряков по методике С.И. Сердюка.

11.Как определить оптическую плотность спермы?

12.Как построить калибровочную кривую?

13.Какой должна быть калибровочная кривая по конфигурации?

14.Почему необходимо строго соблюдать методику определения оптической плотности?

15.Как определить коэффициент-множитель?

16.Какова точность определения концентрации с помощью КФК?

17.Какие ошибки возможны при работе КФК?

18.Как правильно работать с кюветами?

19.Как следует мыть кюветы?

60

синьки зависит от концентрации спермиев и интенсивности их дыхания.

Чем интенсивнее поглощается кислород, тем скорее наступает обесцвечивание, тем лучше оплодотворяющая способность спермиев. На предметное стекло наносят 1 каплю спермы + 1 каплю синьки – смешивают и набирают в стеклянную трубочку столбиком длиной 2 см. Трубочку кладут на лист белой бумаги и наблюдают за временем обесцвечивания (обычно середина обесцвечивается, а на конце остаются кольца). Исследование проводят при температуре 20-22ºС. Результаты интерпретируют по таблице 4.

Задание 3: изучить различные способы хранения спермы.

Существует несколько методов хранения спермы быков, баранов, хряков и жеребцов: кратковременное – при плюсовых температурах и длительное – в замороженном состоянии в жидком азоте для спермы быков и жеребцов.

Хранение спермы быка и барана при температуре плюс

2-4°С. Разбавленную сперму разливают во флаконы (ампулы, пробирки и пр.) и выдерживают сперму быка при комнатной температуре (18-25°С) в течение 20-30 мин с момента разбавления, а сперму барана – 10-15 мин. Затем емкости со спермой помещают в бытовой электрохолодильник или термос со льдом. Для предотвращения температурного шока спермиев используют термоизолирующие приспособления (вату, поролон и пр.) с тем, чтобы сперма охладилась до 2-4°С в течение 3-4 ч. В термосе должно быть не менее 1/3 емкости тающего льда. Флаконы со спермой герметизируют в полиэтиленовых или резиновых упаковках. Упаковка со спермой может находиться на поверхности льда, либо обкладываться льдом со всех сторон. По мере таяния льда талую воду из термоса сливают и добавляют лед. При сохранении спермы в электрохолодильниках лучше ставить флаконы не прямо на полку, а помещать их в емкость с водой, охлажденной до 2-4°С.

При любом способе транспортировки не следует допуска сильного встряхивания и взбалтывания спермы, полного использования льда и повреждений термосов. Сосуды со спермой должны быть промаркированы, к ним необходимо прилагать накладные (ордера) с соответствующей информацией. Разбавленную сперму быка, сохраненную при 2-4°С, используют для искусственного

63

осеменения коров и телок в течение 3 суток, при активности спермиев не ниже 7 баллов, сперму барана используют в течение 2 сут, иногда 36 ч, при активности спермиев не ниже 8 баллов.

Хранение спермы жеребца при температуре 2-4°С. Разбав-

ленную сперму фасуют в стерильные стеклянные баночки объемом 50-100 мл, закрываемые притертыми пробками, помещают в полиэтиленовый мешочек и кладут в термос со льдом. Для хранения и перевозки спермы используют термос конструкции Всероссийского научно-исследовательского института коневодства. Используют сперму для осеменения кобыл в течение 48 ч.

Хранение спермы хряка при температуре 16-20°С. Сперму разливают в стеклянные колбы или полиэтиленовые флаконы, негерметично их прикрывают целлофаном или пергаментной бумагой и хранят в темном месте при температуре 16-20°С.

Во время транспортировки посуду плотно закрывают. Сперму используют для осеменения свиноматок в течение 3 сут с активностью спермиев не ниже 6 баллов.

Замораживание и длительное хранение спермы быка.

Станции и племпредприятия по искусственному осеменению широко применяют метод замораживания и длительного хранения спермы быков в жидком азоте при температуре -196°С. В таком состоянии сперму можно хранить в течение многих месяцев или нескольких лет без потери оплодотворяющей способности. Используют для замораживания сперму с активностью спермиев не ниже 8 баллов.

Замораживание спермы в форме гранул на фторопласто-

вых пластинках. Перед разбавлением среду подогревают до 30-35°С. Этой средой сперму разбавляют в 2,10 раз и более, в зависимости от объема гранул. Если применяют концентрированные гранулы спермы объемом по 0,1-0,2 мл, то для них требуются меньшие степени разбавления. На пункте искусственного осеменения гранулы спермы по 0,1-0,2 мл дополнительно разбавляют. Для этого их перед осеменением коров оттаивают во флаконе с 1 мл 2,9% раствора лимоннокислого натрия, подогретого до температуры 38-40°С. Для замораживания спермы в гранулах объемом 0,5-1,0 мл сперму разбавляют в 10 раз и более. Такие гранулы перед осеменением коров не требуют дополнительного разбавления.

Если гранулы объемом 0,5 мл, то перед осеменением коров

64