ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 18.07.2019
Просмотров: 2166
Скачиваний: 2
51
Техніка користування фазово-контрастним пристроєм така:
1. Звичайний конденсор у світловому мікроскопі замінюють на
фазово-контрастний. Диск револьвера мікроскопа повертають
так, щоб у віконці з'явилась цифра "0".
2. Замінюють об'єктив 40 х на об'єктив 40 х Ф (фазовий).
3. На предметний столик кладуть препарат (наприклад, "роздавлена
крапля" при дослідженні живих бактерій). Установлюють світло
за Келером, користуючись об'єктивом 8х.
4. Встановлюють об'єктив 40 х Ф.
5. Замінюють окуляр на допоміжний мікроскоп. Переміщуючи ту-
бус мікроскопа, домагаються чіткого фокусування фазової
пластинки об'єктива (має вигляд темного кільця).
6. Повернувши диск револьвера, вмикають кільцеву діафрагму, яка
відповідає об'єктиву 40 х ф. При цьому з'являється не лише
фазове кільце, а й кільце-щілина діафрагми.
7. За допомогою гвинтів для центрування зміщують кільцеву діа-
фрагму таким чином, щоб вона збіглася з фазовим кільцем.
8. Допоміжний мікроскоп замінюють на окуляр і фокусують пре-
парат.
9. Якщо мікроскопію здійснюють з використанням інших об'єктів,
установлюють відповідні кільцеві діафрагми і щоразу проводять
центрування, користуючись допоміжним мікроскопом.
ЗАВДАННЯ.
1. Визначити концентрацію мікроорганізмів під час культивування на
рідкому поживному середовищі (МПБ) прямим методом.
52
РОЗДІЛ 2.
ВИДІЛЕННЯ
ТА
ОЧИЩЕННЯ
ПРОДУКТІВ
БІОСИНТЕЗУ
ШТАМІВ СУПЕРПРОДУЦЕНТІВ.
Лабораторна робота №1
МЕТОДИ ДЕЗІНТЕГРАЦІЇ КЛІТИН
Мета: опанувати основні методи дезінтеграції клітин бактеріальної
маси.
Біотехнологічний процес отримання цільового продукту обов‘язково
містить стадію виділення та очищення продуктів біосинтезу.
Цільовим продуктом може бути власне клітини або продукти їх
метаболізму:
Зовнішньо клітинні, що виділяються у культуральну
рідину;
Внутрішньоклітинні, що містяться всередині клітини.
У культуральній рідині після закінчення процесу культивування
містяться
власне
клітини
(зокрема,
мікроорганізми),
продукти
метаболізму, залишки поживного середовища, додаткові речовини, що
використовуються під час культивування (наприклад, піногасник). Тому,
незалежно від кінцевого продукту, на першому етапі виділення необхідно
розділити тверду фазу (завісь клітин) від рідкої фази.
Вибір методу виділення нерозчинних речовин (клітин) залежить від:
характеристики культуральної рідини (в’язкість, щільність,
концентрація клітин, наявність домішок);
необхідного ступеня очищення цільового продукту.
Для виділення внутрішньоклітинного продукту біосинтезу клітин,
останні необхідно зруйнувати таким чином, щоб цільовий продукт
залишився неушкодженим. Найчастіше це досягається методом
дезінтеграції – процесу подрібнення різних матеріалів, руйнації клітин
(мікроорганізмів, зокрема) шляхом розриву клітинних оболонок. У
біотехнології дезінтеграція означає процес незворотного порушення
цілісності клітин (вірусів).
53
Вибір методу дезінтеграції обумовлено різноманітністю типів клітин:
від еритроцитів, які легко руйнуються до клітин деяких бактерій, для
руйнування яких необхідна сильна механічна дія. Це обумовлено тими
характерними параметрами клітини як: розмір клітини, щільність,
міцність, пружність та в‘язкість клітинної оболонки. Для деяких клітин
рослин та мікроорганізмів властива виключно висока механічна міцність
клітинних стінок, межа міцності яких дорівнює 10
8
дин/см, це приблизно
відповідає межі міцності сталі. Для руйнації таких структур необхідний
вплив високої інтенсивності порядку 10
8
с
-1
і більше. Такий вплив
призводить до небажаних явищ інактивації, модифікації й деградації
цільових компонентів, що становить основну проблему штучної
інструментальної дезінтеграції.
На процес руйнації впливає навколишнє середовище. Воно виступає як
пасивний передавач енергії (механічної, теплової) від дезінтегратора до
клітини, або як активний елемент процесу інтенсивної дії на клітинні
оболонки (хімічна, хімікоекстрактивна, ензиматична, ензимоосмотична). У
це середовище виходять цільові клітинні компоненти де піддаються
змінам.
З практичної точки зору для руйнації клітини достатньо розірвати
клітинну оболонку різними факторами пошкодження: фізичними,
механічними, хімічними, ензиматичними та біологічними. Тому методи
руйнування клітин поділяють за силою дії та методами впливу.
ЗА СИЛОЮ ДІЇ (за Скоупс, 1985 р.) усі методи поділяються на:
способи руйнування за м‘якою дією на клітини, які руйнуються
дуже легко (так, принцип дезінтеграції еритроцитів полягає у
м‘якій дії осмотичного руйнування клітинної стінки; для
руйнування клітин клітинних ліній достатньо одноразове
заморожування та відтанення);
способи руйнування клітин з застосуванням дії середньої сили (за
допомогою гомогенізатора механічно руйнуються великі клітини
більшості тваринних та рослинних тканин);
способи руйнування клітин з застосуванням сильної дії (руйнація
міцної клітинної оболонки бактерій за допомогою ультразвуку).
Дезінтеграція різних типів клітин може досягатися:
54
1. фізичними методами:
механічні (екструзія, ультразвук, газодекомпрессія)
немеханічні (осмотичний, тепловий, холодовий шок,
заморожування-відтанення, дегідратація-регідратація)
2. хімічними методами:
дія лугів, кислот, солей, детергентів, інгібіторів,
органічних розчинників;
3. ензиматичними методами:
дія ферментів (літичні ферменти бактерій, дріжджів,
грибів).
4. біологічними методами: дія фагів, бактерицидів.
Для практичного руйнування клітин застосовуються комбіновані
методи.
В результаті дезінтеграції отримуємо дезінтеграт, який, після
видалення цілих клітин, що залишилися, вже називається без клітинний
екстракт.
Для дезінтеграції фізичними методами застосовують спеціальні
прилади — дезінтегратори. За принципом роботи дезінтегратори
розрізняють: балістичні, вібраційні, бісерні, ультразвукові, екструзійні
та ін. У біотехнологічній промисловості найбільш популярними є
балістичні, екструзійні та ультразвукові дезінтегратори.
БАЛІСТИЧНІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ характеризуються тим, що
перенесення енергії від робочих органів дезінтегратора до клітини
відбувається безпосередньо, під час механічного контакту або через тіла,
що перемелюють. Відповідно усі балістичні дезінтегратори поділяються
на:
1. Дезінтегратори, що розтирають та чавлять (енергія
робочих органів передається клітинам безпосередньо);
2. Дезінтегратори з вільними тілами, що перемелюють (енергія
від робочих органів до клітин переноситься опосередковано);
3. Дезінтегратори,
які
мають
агреговані
тіла,
що
перемелюють (енергія від робочих органів до клітини
переноситься безпосередньо або опосередковано);
4. Дезінтегратори ударної дії;
5. Колоїдні млини.
55
Приклади балістичних дезінтеграторів наведені у таблиці 4.
Таблиця 4.
БАЛІСТИЧНІ ДЕЗІНТЕГРАТОРИ МІКРООРГАНІЗМІВ
Тип
Призначення
Корисний
об’єм
камери,
см
3
Дезінтегратори, що розтирають та чавлять
Мікроступка ручна
Аналітичні дослідження
3
Лабораторні
ступки
ручні
Сухе та вологе розтирання клітин у
присутності абразивних речовин
20-1000
Механізовані
та
автоматизовані
ступкові
млини
та
агрегати
Розтирання дріжджів
150
мікрогомогенгезатор
Руйнація тканин
1-3
Гомогенізатор Поттера Лабораторні дослідження
1-60
Тканинний
гомогенізатор
Дезінтеграція тваринних клітин
23
Дезінтегратори з вільними тілами, що перемелюють
Мікромлин-ступка
з
пестом
Сухе та вологе подрібнення
10
Кріогенний млин
Руйнація бактерій та спор у
кріогенному стані
1
Гомогенізатор Л-17
Руйнація дріжджів та бактерій
2х50
Дезінтегратор-насадка
до центрифуги ЦЛР
Універсальний
лабораторний
дезінтегратор бактерій, дріжджів,
грибів та спор
2х100
4х100
Дезінтегратори, які мають агреговані тіла, що перемелюють
Дезінтегратор
низькочастотний
з
пористою перетинкою
Проточний лабораторний прилад
для дезінтеграції бактерій
100
Дезінтегратори ударної дії
Міксери, блендери
Дезінтеграція
заморожених
та
висушених мікробних, рослинних
та тваринних біомас
100-800
Кріогенні подрібнювачі Дезінтеграція біомас у криогенних
умовах
500