Файл: Прокариоты как объект биотехнологии. Особенности репликации и транскрипции у прокариотов.docx

С помощью прокариот получают вино, молочные продукты, закваски и другие пищевые продукты, ацетон и бутанол, этанол, уксусную и лимонную кислоты, витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Бактерии участвуют в трансформации стероидных гормонов.

Транскрипция и трансляция. Оба этапа протекают в цитоплазме. Синтез всех видов РНК у прокариот осуществляет один тип РНК-полимераз.

Процессы транскрипции и трансляции у бактерий сопряжены –

как только синтезируется свободный 5‘-конец мРНК

определенной длины, рибосомы садятся на него и начинают

синтез белка (трансляцию)

Технология рекомбинантных ДНК (стадии и краткое описание).

Суть этой технологии заключается в соединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением рекомбинантных генетических структур в живую клетку.

Этапы генетического конструирования in vitro:

1. Получение нужного гена (выделение нужных генов из ДНК, химико-ферментативный синтез, ферментативный синтез гена на основе выделенной мРНК);

2. Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;

3. Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli;

4. Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;

5. Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.

6. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.

Билет 8

Строение оперона. Особенности экспрессии эукариотических белков в клетках прокариот.

Промотор - участок оперона, служащий для узнавания ферментом РНК-полимеразой.

Последовательность оснований по ходу цепи ДНК ниже сайта промотора с направлением 3’->5’ используется в качестве матрицы для синтеза РНК.

После промотора в опероне находится акцепторная зона (у эукариот) или оператор (у прокариот), которая служит для связывания с регуляторами транскрипции (например, усилителями – энхансерами или репрессорами). Оператор разрешает или запрещает транскрипцию.

Терминатор –участок, где прекращается дальнейший рост цепи РНК и происходит ее освобождение от матрицы ДНК. Репрессор – регуляторный белок, подавляющий транскрипцию генов регулируемого им оперона в результате связывания с оператором (регуляторным участком оперона).

Цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну тРНК, или одну рРНК.

В результате транскрипции образуется полицистронная мРНК.

Получение генов для экспрессии в клетках прокариот и эукариот возможно несколькими путями: выделением из ДНК (проводят с помощью рестриктаз , химико-ферментативным синтезом (применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген ) или ферментативным синтезом на основе выделенной матричной РНК (мРНК) (Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНКполимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния).

Получение и использование иммобилизованных клеток микроорганизмов. Сравните с иммобилизованными ферментами.

Иммобилизация клеток обычно производится их адсорбцией но водонерастворимых носителях (часто но ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или путем захвата их в полимер, кок правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации. Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает их размножение и обычно увеличивает сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными клетками.

Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с иммобилизованными ферментами заключаются главным образом в том, что при их использовании отпадают наиболее дорогостоящие стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов. Кроме того, ферменты в клетке находятся в своем естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности, а также стабильности в условиях непрерывной ферментации.

Билет 9

Строение транскриптона эукариот. Особенности экспрессии эукариотических белков в клетках прокариот.

Фрагмент молекулы ДНК, включающий промотор,транскрибируемую последовательность и терминатор, образует единицу транскрипции — транскриптон.

Неинформативная зона включает промотор + инициатор, группы генов оперторов. Информативная зона образована структурным геном, разделенным на экзоны и интроны. Заканчивается транскриптон терминатором. Работу транскриптона регулируют несколько генов-регуляторов, дающих или кодирующих синтез нескольких белков-репрессоров. Потому что индукторами эукариот являются сложные молекулы для расщепления которых требуется несколько ферментов.
Промотор – особый участок в молекуле ДНК, который указывает место начала транскрипции. Оператор – определенные нуклеотидные последовательности ДНК, предшествующие структурной части регулируемого гена. Включает и выключает работу структурных генов. Терминатор –участок, где прекращается дальнейший рост цепи РНК и происходит ее освобождение от матрицы ДНК. Репрессор – регуляторный белок, подавляющий транскрипцию генов регулируемого им оперона в результате связывания с оператором (регуляторным участком оперона). Индуктор – небольшая эффекторная молекула, связывающаяся с регуляторным белком, или физический фактор (свет, температура), которые стимулируют экспрессию генов, находящихся в неактивном состоянии.
Получение генов для экспрессии в клетках прокариот и эукариот возможно несколькими путями: выделением из ДНК (проводят с помощью рестриктаз , химико-ферментативным синтезом (применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген ) или ферментативным синтезом на основе выделенной матричной РНК (мРНК) (Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНКполимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния).

Схема получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов. Условия культивирования и ключевые стадии выделения.

Билет 10

Технологическая схема получения инсулина человека методом внутриклеточной экспрессии на основе проинсулина. Условия культивирования продуцента.

Состав питательной среды:

Бактопептон

Дрожжевой экстракт

Калий фосфорнокислый двузамещенный

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Натрий хлористый

Магний сернокислый

Глюкоза

Условия культивирования (8 ч):

37^оС, рН7,0, Р_и= 0,25 атм

Рестрикционные эндонуклеазы: свойства и применение в генетической инженерии.

Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять (гидролизовать) ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.

Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

Билет 11

Использование иммобилизованных ферментов. Приведите примеры (химические реакции) промышленных процессов с иммобилизованными ферментами.

Получение безлактозного молока:

Лактаза — это фермент из семейства β-галактозидаз, лактаза гидролизует гликозидные связи и принимает участие в гидролизе дисахарида лактозы. В результате гидролиза одной молекулы лактозы образуется молекула галактозы и глюкозы. Безлактозное молоко - продукт переработки питьевого молока, в котором лактоза гидролизована или удалена.

Продукт предназначен для людей, страдающих непереносимостью лактозы. Используют лактозу из грибов рода Aspergillus. Если в литре обычного молока содержится около 50 г лактозы, то после добавления фермента её остаётся не более 1 г.

Разделение рацемических смесей аминокислот на изомеры с помощью иммобилизованной аминоацилазы:

Аминоацилаза из почек свиньи катализирует гидролиз амидных связей L-аминокислот, но не D-аминокислот. Сначала рацемическую смесь аминокислот ацетилируют уксусным ангидридом, затем обрабатывают аминоацилазой. Образовавшуюся L-аминокислоту отделяют от N-ацетил-D-аминокислоты по разнице растворимостей. N-ацетил-D-аминокислоту обрабатывают разбавленной кислотой при нагревании и получают свободную D-аминокислоту.

N-ацетил-D-аминокислоту можно подвергнуть рацемизации и вновь обработать аминоацилазой, повторяя эти стадии до получения L-аминокислоты в качестве единственного продукта.

Контроль реакции рестрикции ДНК методом электрофореза.

Reaction Conditions:
1X NEBuffer 4
Incubate at 37°C.

1X NEBuffer 4:
20 mM Tris-acetate
50 mM potassium acetate
10 mM Magnesium Acetate
1 mM Dithiothreitol
pH 7.9 @ 25°C

Билет 12

Значение таксономического признака «окраска по Граму». Как его определяют?

Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий.

Грамположительные бактерии хорошо удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом. После обработки фуксином они окрашиваются в фиолетово-пурпурный цвет.
Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, то есть теряют комплекс генцианового фиолетового с йодом, и хорошо поглощают фуксин. В мазках они окрашиваются в малиново-красный цвет.