ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 26.10.2023
Просмотров: 281
Скачиваний: 6
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
масел (соевого, арахисового, рапсового, оливкового) повышает выход продукта трансформации. Аналогичные результаты получены с применением глицеридов животного и растительного происхождения. Механизм – в устранении гидрофобности стеринов (глицериды действуют как неионные ПАВ).
Т: 24—33°С.
Микробиологический контроль: только на стадии выращивания трансформирующей культуры.
Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии в присутствии «свидетелей» (стандартные вещества – исходный стероид, целевой продукт трансформации и некоторых промежуточные и побочные продукты).
После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствующего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ).
Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активированным углем, затем уголь отфильтровывают); далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоночной хроматографии.
Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования.
Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду до засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80°С и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин среду со стероидом охлаждают до 33°С и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.
Правильность преобразования стероидного субстрата контролируют, сочетая химический подход со специфичностью биологической системы. Например, образование уксуснокислого эфира препятствует другим побочным реакциям.
ПРОБЛЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ
Главным препятствием, стоящим на пути микробиологических трансформаций стеринов, является низкая производительность ферментации, несмотря на высокий процентный выход по субстрату. Это обусловлено:
1. Деградация субстрата.Решение:регулярное его добавления или использования других микроорганизмов. Кроме того, ход синтеза можно контролировать, применяя метод химической модификации. Так, метилирование по 16α-положению подавляет нежелательное восстановление кетогруппы при С20, а образование уксуснокислого эфира по С17 стереохимически препятствует другим побочным реакциям.
2. Проблема растворимости стероидов.
Стероиды – малорастворимые в воде соединения: (растворимость: 0,3 – 0,01 г/л). Решение:
• стероид сильно измельчается (поступает в среду в микронизированном виде).
• подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.). Ограничение: токсичность определенных концентраций растворителей.
• использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Трудности: высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов (для некоторых микроорганизмов эти формы стероидов оказались недоступны).
• заключение стероидов в растворимый комплекс с циклодекстрином (природные циклические олигосахариды, внешняя поверхность – гидрофильная, внутренняя – гидрофобная).
Одним из путей интенсификации процессов трансформации является предварительное индуцирование растущей культуры-трансформаторасоответствующим субстратом или его аналогом (при этом индуцируются соответствующие ферментные системы, применяется в процессах микробиологической дегидрогенизации).
Примеры промышленного использования микробиологических трансформаций
Получение вещества S
Ключевым веществом в производстве кортикостероидов является «вещество S Рейхштейна», стадия его получения в значительной степени определяет конечный выход готовых продуктов следующих трансформаций.
Вещество S является модифицированным продуктом биотрансформации моноацетата «вещества R» с помощью культуры
Corynebacterium mediolanum. Этот процесс состоит из следующих стадий:
- гидролиза 21-ацетогруппы
- окисления 3β-гидроксигруппы в 3-кетогруппу
- перемещения двойной связи от С-5 к С-4.
Для коринебактерий нехарактерны реакции расщепления стероидной молекулы → выход вещества S очень большой (почти количественный).
КОРТИЗОЛ из ВЕЩЕСТВА S
Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества S осуществляется с помощью плесневого гриба Сurvukaria linata.
Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.
2. Трансформация вещества S (стерилизация ферментера и воздушного фильтра формалином, добавка антибиотика и пеногасителей)
3. Выделение продукта трансформации — гидрокортизона. Культуральная жидкость вместе с мицелием поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем.
Микробиологическое гидроксилирование
Это наиболее важный и часто применяемый метод. Наличие гидроксильных групп в 3, 11, 16, 17 положениях молекулы стероида, как правило, обусловливает физиологическую активность большинства гормональных стероидных препаратов.
Гидроксилирование стероидов осуществляется очень многими микроорганизмами, чаще всего грибами.
Гидроксилированию подвергаются субстраты самого различного строения. Причина этого: очень широкая субстратная специфичность гидроксилаз, которую демонстрируют многие микроорганизмы.
Гидроксилирование прогестерона
Первым запатентованным процессом микробной трансформации стероидов является процесс 11-α-гидроксилирования прогестерона некоторыми видами грибов, разработанный еще в 1937 г., но внедрить его в промышленность удалось лишь 1952 г. При этом синтез кортизона сократился до 11 стадий вместо 37. В качестве микроорганизма трансформатора применяется плесневый гриб рода ризопус.
Дегидрогенизация (ГИДРОКОРТИЗОН в ПРЕДНИЗОЛОН)
Распространенность этой реакции объясняется:
• наличием соответствующих дегидрогеназ у большого числа микроорганизмов,
• доступность связи 1,2 и 4-5 для микробных оксидоредуктаз (особенно при наличии кетогруппы в 3-м положении и (или) двойной связи 4,5).
Наличие двойных связей коренным образом влияет на физиологическую активность препаратов (преднизолон).
Удалось снизить стоимость этого препарата в 200 раз.
Широкая субстратная специфичность дегидрогеназ позволяет использовать в качестве субстратов ацетаты стероидов, которые являются полупродуктами во многих технологических схемах получения стероидов.
Пример: Mycobacteriumglobiformeэффективно превращает и кортизонацетат в преднизонацетат с выходом 86%.
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ СТЕРОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУР РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Биотрансформация стероидов с использованием культур растительных клеток
имеет целый ряд преимуществ перед микробиологической трансформацией. Так, если трансформация в положения 3 и 5 характерна практически для всех используемых культур (микроорганизмы, растительные клетки), то реакции Iβ-, 4β-, I2β- (дигитоксин в дигоксин), 16β-гидроксилирования и изомеризации 17β-лактонного кольца, осуществляются только некоторыми культурами растительных клеток, и сильно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации.
Пример: дигитоксин в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой) – 12-гидроксилирование.
Недифференцированные культуры Digitalis не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду.
Использование соевой муки
Изучение влияние различных источников углеводов и азота на процесс биотрансформации холестерина в андростендион легло в основу разработки новой композиции ферментационной среды, в состав которой не вошла соевая мука. Исключение этого белкового компонента из композиции питательной среды дает положительный эффект при дальнейших стадиях (выделение и химическая очистка) получения конечного продукта.
Микробиологическое восстановление
Селективность действия микробных ферментов позволяет восстановить определенную кето-группу стероидов (химическим путем это невозможно).
Гидролиз эфиров стероида
Использование гидролиза эфиров стероидов имеет практическое значение, так как ацилированные стероиды являются обычными промежуточными продуктами химического синтеза, в котором применяется ацильная защита функциональных групп. Хотя гидролиз ацильной группы легко осуществим химическим путем, он часто приводит к побочным нежелательным продуктам.
Микробиологическое расщепление эфирной связи осуществляется флавобактериями, актиномицетами, мукоровыми и несовершенными грибами.
Ценность представляют как культуры, избирательно отщепляющие ацильную группу, так и микроорганизмы, способные наряду с гидролизом эфирной связи осуществлять еще какую-либо практически важную реакцию.
Пути интенсификации микробиологических трансформаций
Т: 24—33°С.
Микробиологический контроль: только на стадии выращивания трансформирующей культуры.
Аналитический контроль реакции трансформации ведется путем отбора проб через определенные временные интервалы и анализа их методом тонкослойной хроматографии в присутствии «свидетелей» (стандартные вещества – исходный стероид, целевой продукт трансформации и некоторых промежуточные и побочные продукты).
После завершения трансформации культуральная жидкость, отделенная от мицелия (или другой биомассы), экстрагируется несмешивающимся с водой органическим растворителем, пригодным для растворения соответствующего стероида (этилацетат, метиленхлорид или хлороформ).
Экстракт, отделенный от водной фазы, проходит требуемую очистку (окрашенные примеси обычно отделяют обработкой с активированным углем, затем уголь отфильтровывают); далее его концентрируют в вакууме и полученный осадок стероида перекристаллизовывают из подходящего растворителя. В препаративных целях при работе с небольшими количествами стероидов очистку продукта трансформации можно проводить методом колоночной хроматографии.
Все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях. Однако внесение стероидного субстрата на трансформацию и сам процесс трансформации, как правило, проводят не стерильно. Для уменьшения вероятности загрязнения используют стерильную воду при приготовлении суспензии стероидных субстратов, поскольку сами стероиды обычно неустойчивы в условиях автоклавирования.
Одним из вариантов решения этой проблемы может служить способ внесения стероидного субстрата в питательную среду до засева ее трансформирующей культурой в момент, когда температура среды после автоклавирования снизится до 80°С и безопасна для субстрата. После выдержки в течение 30 мин среду со стероидом охлаждают до 33°С и в нее стерильно вносят трансформирующую культуру.
Правильность преобразования стероидного субстрата контролируют, сочетая химический подход со специфичностью биологической системы. Например, образование уксуснокислого эфира препятствует другим побочным реакциям.
ПРОБЛЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ
Главным препятствием, стоящим на пути микробиологических трансформаций стеринов, является низкая производительность ферментации, несмотря на высокий процентный выход по субстрату. Это обусловлено:
1. Деградация субстрата.Решение:регулярное его добавления или использования других микроорганизмов. Кроме того, ход синтеза можно контролировать, применяя метод химической модификации. Так, метилирование по 16α-положению подавляет нежелательное восстановление кетогруппы при С20, а образование уксуснокислого эфира по С17 стереохимически препятствует другим побочным реакциям.
2. Проблема растворимости стероидов.
Стероиды – малорастворимые в воде соединения: (растворимость: 0,3 – 0,01 г/л). Решение:
• стероид сильно измельчается (поступает в среду в микронизированном виде).
• подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др.). Ограничение: токсичность определенных концентраций растворителей.
• использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Трудности: высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов (для некоторых микроорганизмов эти формы стероидов оказались недоступны).
• заключение стероидов в растворимый комплекс с циклодекстрином (природные циклические олигосахариды, внешняя поверхность – гидрофильная, внутренняя – гидрофобная).
Одним из путей интенсификации процессов трансформации является предварительное индуцирование растущей культуры-трансформаторасоответствующим субстратом или его аналогом (при этом индуцируются соответствующие ферментные системы, применяется в процессах микробиологической дегидрогенизации).
Примеры промышленного использования микробиологических трансформаций
Получение вещества S
Ключевым веществом в производстве кортикостероидов является «вещество S Рейхштейна», стадия его получения в значительной степени определяет конечный выход готовых продуктов следующих трансформаций.
Вещество S является модифицированным продуктом биотрансформации моноацетата «вещества R» с помощью культуры
Corynebacterium mediolanum. Этот процесс состоит из следующих стадий:
- гидролиза 21-ацетогруппы
- окисления 3β-гидроксигруппы в 3-кетогруппу
- перемещения двойной связи от С-5 к С-4.
Для коринебактерий нехарактерны реакции расщепления стероидной молекулы → выход вещества S очень большой (почти количественный).
КОРТИЗОЛ из ВЕЩЕСТВА S
Получение гидрокортизона (кортизола) из вещества S осуществляется с помощью плесневого гриба Сurvukaria linata.
-
Выращивание трансформирующей культуры производят путем трех последовательных генераций на питательной среде, содержащей сахарозу, дрожжевой автолизат и сложный набор неорганических солей.
Крышку инокулятора перед засевом обрабатывают водным раствором формалина, аппарат и все помещение облучают бактерицидной лампой и весь процесс выращивания трансформирующей культуры проводят в стерильных условиях. Далее полученная трансформирующая культура поступает в сепаратор, откуда отделенный мицелий в виде водной суспензии передается в ферментер для проведения основной реакции трансформации вещества S.
2. Трансформация вещества S (стерилизация ферментера и воздушного фильтра формалином, добавка антибиотика и пеногасителей)
3. Выделение продукта трансформации — гидрокортизона. Культуральная жидкость вместе с мицелием поступает на сепарацию. Отделенный мицелий промывается, промывные воды присоединяются к основной культуральной жидкости. Далее производится экстракция-сепарация продукта трансформации из водной среды органическим растворителем. Осветленный активированным углем экстракт подвергается многократному упариванию с различными растворителями, осветлению, снова упариванию досуха и промывке подходящим растворителем.
Микробиологическое гидроксилирование
Это наиболее важный и часто применяемый метод. Наличие гидроксильных групп в 3, 11, 16, 17 положениях молекулы стероида, как правило, обусловливает физиологическую активность большинства гормональных стероидных препаратов.
Гидроксилирование стероидов осуществляется очень многими микроорганизмами, чаще всего грибами.
Гидроксилированию подвергаются субстраты самого различного строения. Причина этого: очень широкая субстратная специфичность гидроксилаз, которую демонстрируют многие микроорганизмы.
Гидроксилирование прогестерона
Первым запатентованным процессом микробной трансформации стероидов является процесс 11-α-гидроксилирования прогестерона некоторыми видами грибов, разработанный еще в 1937 г., но внедрить его в промышленность удалось лишь 1952 г. При этом синтез кортизона сократился до 11 стадий вместо 37. В качестве микроорганизма трансформатора применяется плесневый гриб рода ризопус.
Дегидрогенизация (ГИДРОКОРТИЗОН в ПРЕДНИЗОЛОН)
Распространенность этой реакции объясняется:
• наличием соответствующих дегидрогеназ у большого числа микроорганизмов,
• доступность связи 1,2 и 4-5 для микробных оксидоредуктаз (особенно при наличии кетогруппы в 3-м положении и (или) двойной связи 4,5).
Наличие двойных связей коренным образом влияет на физиологическую активность препаратов (преднизолон).
Удалось снизить стоимость этого препарата в 200 раз.
Широкая субстратная специфичность дегидрогеназ позволяет использовать в качестве субстратов ацетаты стероидов, которые являются полупродуктами во многих технологических схемах получения стероидов.
Пример: Mycobacteriumglobiformeэффективно превращает и кортизонацетат в преднизонацетат с выходом 86%.
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ СТЕРОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУР РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Биотрансформация стероидов с использованием культур растительных клеток
имеет целый ряд преимуществ перед микробиологической трансформацией. Так, если трансформация в положения 3 и 5 характерна практически для всех используемых культур (микроорганизмы, растительные клетки), то реакции Iβ-, 4β-, I2β- (дигитоксин в дигоксин), 16β-гидроксилирования и изомеризации 17β-лактонного кольца, осуществляются только некоторыми культурами растительных клеток, и сильно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации.
Пример: дигитоксин в дигоксин клетками Digitalis lanata (наперстянки шерстистой) – 12-гидроксилирование.
Недифференцированные культуры Digitalis не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять определенные реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду.
Использование соевой муки
Изучение влияние различных источников углеводов и азота на процесс биотрансформации холестерина в андростендион легло в основу разработки новой композиции ферментационной среды, в состав которой не вошла соевая мука. Исключение этого белкового компонента из композиции питательной среды дает положительный эффект при дальнейших стадиях (выделение и химическая очистка) получения конечного продукта.
Микробиологическое восстановление
Селективность действия микробных ферментов позволяет восстановить определенную кето-группу стероидов (химическим путем это невозможно).
Гидролиз эфиров стероида
Использование гидролиза эфиров стероидов имеет практическое значение, так как ацилированные стероиды являются обычными промежуточными продуктами химического синтеза, в котором применяется ацильная защита функциональных групп. Хотя гидролиз ацильной группы легко осуществим химическим путем, он часто приводит к побочным нежелательным продуктам.
Микробиологическое расщепление эфирной связи осуществляется флавобактериями, актиномицетами, мукоровыми и несовершенными грибами.
Ценность представляют как культуры, избирательно отщепляющие ацильную группу, так и микроорганизмы, способные наряду с гидролизом эфирной связи осуществлять еще какую-либо практически важную реакцию.
Пути интенсификации микробиологических трансформаций