ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.04.2021
Просмотров: 14177
Скачиваний: 135
линейная зависимость [Р] от t при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей
концентрации субстрата.
6. Кофакторы. Существуют ферменты, для проявления каталитических свойств которых
необходимо присутствие кофакторов, например, коферментов - производных витаминов, ионов
металлов и др.
Для определения оптимальной концентрации кофактора следует построить кривую зависимости
скорости реакции от концентрации кофактора, аналогичную зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую концентрацию кофактора.
После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо проверить, сохраняется ли
при ней линейная зависимость [Р] от t.
Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в частных статьях.
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ РЕГИСТРАЦИИ
СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
Скорость ферментативной реакции количественно можно измерить по убыли субстрата или по
образованию продукта реакции. Предпочтительнее регистрировать скорость образования продукта,
поскольку это обеспечивает большую точность определения.
Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции используют методы,
связанные с отбором проб из реакционной смеси, и регистрирующие методы, основанные чаще всего
на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции.
Определение белка
Определение содержания белка в препарате проводят одним из методов, приведенных в общей
статье "Определение белка".
ЕДИНИЦЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Активность ферментов выражается в Международных единицах (ME) или единицах действия
(ЕД).
ME - это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение
одного микромоля субстрата за 1 мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в
тех случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата).
ЕД - это условная единица, величина которой указывается в частных статьях.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
Нормируются:
Удельная активность препарата - выражается в единицах ферментативной активности фермента
(ME или ЕД) на 1 мг препарата и на 1 мг белка (вторая величина характеризует чистоту препарата).
Доза выражается в единицах ферментативной активности (ME или ЕД) на единицу
лекарственной формы.
Определение активности ферментных препаратов
в сравнении со стандартным образцом
С целью снижения погрешности методов определения ферментативной активности необходимо
проводить определение ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным
образцом. Стандартным образцом является высокоочищенный ферментный препарат, качество
которого отвечает требованиям соответствующей нормативно - технической документации.
Определение ферментативной активности испытуемого препарата и стандартного образца
проводят в одинаковых условиях опыта.
Активность препарата (А) в соответствующих единицах (ME или ЕД) вычисляют по формуле:
Ас х Пс х К
А = ---------------
Пр
где Ac - ферментативная активность стандартного образца в единицах (ME или ЕД) на миллиграмм
белка или препарата; Пс - величина измеряемого параметра для стандартного образца; Пр - величина
измеряемого параметра для испытуемого препарата; К - коэффициент, выравнивающий
концентрации растворов испытуемого препарата и стандартного образца.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТАХ
Белки - высокомолекулярные природные органические вещества, построенные из L-
аминокислот.
Для количественного определения белка используют колориметрические и
спектрофотометрические методы, в некоторых случаях пользуются определением белка по
содержанию общего азота в препарате.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
1. Колориметрические методы определения белка
При определении белка в лекарственных препаратах при помощи колориметрических методов
предварительно строят калибровочный график с использованием стандартного образца белка,
указанного в частных статьях (бычьего сывороточного альбумина, сывороточного альбумина
человека или аминокислоты тирозина).
При определении белка в испытуемых пробах соблюдают те же условия проведения реакций и
измерения поглощения растворов, что и при построении калибровочного графика.
1. Определение белка с биуретовым реактивом
Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса
ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.
Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно -
аммиачных комплексов.
1 мл раствора препарата, содержащего 1-10 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной
температуре. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны в
диапазоне от 540 до 650 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения
используют смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 1 до 10 мг стандартного образца
белка, измеряя оптическую плотность растворов при выбранной длине волны.
2. Микроопределение белка с реактивом Бенедикта
Принцип метода тот же, что и при определении белка с биуретовым реактивом.
2 мл раствора препарата, содержащего 0,1-2 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 2 мл 6% раствора натра едкого, 0,2 мл реактива Бенедикта, перемешивают и оставляют
на 15 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при
длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют
смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,1 до 2 мг стандартного образца
белка, измеряя оптическую плотность раствора при 330 нм.
3. Определение белка по методу Лоури
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот и цистеина
с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.
1 мл раствора препарата, содержащего 0,025-0,250 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 2 мл реактива 1 и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем прибавляют
0,5 мл реактива Фолина, перемешивают и через 30-40 мин измеряют оптическую плотность на
спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,025 до 0,250 мг стандартного
образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 750 нм.
4. Определение белка по методу Лоури
в модификации Сяткина
Метод Лоури в модификации Сяткина используют для определения содержания белка в
препаратах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов.
0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,5-2,5 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 0,8 мл раствора натра едкого (1 моль/л) и 0,1 мл 1% раствора натрия дезоксихолата, затем
прибавляют 4 мл реактива II, смесь перемешивают. После просветления раствора прибавляют 0,5 мл
реактива Фолина, немедленно перемешивают и оставляют на 30 мин в темном месте при комнатной
температуре. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 750 нм в
кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов
без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,5 до 2,5 мг стандартного образца
белка, измеряя оптическую плотность растворов при 750 нм.
5. Определение белка по методу Бредфорд
Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет комплекса красителя кумасси ярко -
голубого G-250 с белком.
0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,10 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 5 мл реактива Бредфорд, перемешивают и оставляют при комнатной температуре в
течение одинакового времени в интервале от 2 до 60 мин. Оптическую плотность измеряют на
спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до 0,10 мг стандартного
образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 595 нм.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
6. Определение белка по методу Седмака
Принцип метода тот же, что и в методе Бредфорд. Метод применим для определения
суммарного количества белков и полипептидов с молекулярной массой более 3000 дальтон.
1,5 мл раствора препарата, содержащего 0,010-0,150 мг испытуемого белка, помещают в
пробирку, прибавляют 1,5 мл раствора кумасси ярко - голубого G-250, перемешивают и выдерживают
при комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от 5 мин до 3 ч.
Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при двух длинах волн: 620 и 465 нм в кювете
с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без
препарата и кумасси ярко - голубого G-250.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,005 до 0,150 мг стандартного
образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 620 и 465 нм и откладывая по оси
ординат отношение оптических плотностей (D620/D465), по оси абсцисс - соответствующие
значения концентрации растворов стандартного образца белка.
7. Определение белка по методу Флореса
Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет комплекса белка с красителем
бромфеноловым синим.
Комплекс устойчив в течение 8 ч.
0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,08 мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 0,9 мл раствора бромфенолового синего, выдерживают при комнатной температуре в
течение одинакового времени в интервале от 10 мин до 8 ч. Оптическую плотность измеряют на
спектрофотометре при длине волны 610 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до 0,08 мг стандартного
образца белка (почти прямолинейная зависимость), измеряя оптическую плотность растворов при
610 нм.
II.Спектрофотометрический метод определения белка
Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности ароматических
аминокислот (триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый
свет с максимумом поглощения при 280 нм.
Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина
оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют растворитель препарата.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.