ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.04.2021
Просмотров: 14178
Скачиваний: 135
Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л.
Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов
(более 20%). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух
длинах волн - 260 и 280 нм; содержание белка Х (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара:
Х = 1,45 х D280 - 0,74 х D260.
III. Определение белка по содержанию общего азота
Определение белка по содержанию общего азота основано на том, что содержание азота в
большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. В том случае, если
лекарственный препарат, кроме белка, содержит другие вещества, в состав которых входит азот,
белок предварительно осаждают трихлоруксусной или хлорной кислотой. При нагревании
органического соединения с концентрированной серной кислотой происходит его минерализация,
азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить количественно.
1. Микрометод Кьельдаля
Определение проводят в соответствии со статьей "Определение азота в органических
соединениях" (ГФ XI, вып. 1, с. 180) со следующими дополнениями: навеску препарата, содержащую
10-20 мг испытуемого белка, помещают в колбу "в", затем осторожно прибавляют 0,25 г растертой
смеси калия сульфата, меди сульфата и натрия селената, взятых в соотношении 20:5:8,5, и 2 мл
концентрированной серной кислоты. Проводят минерализацию, нагревая колбу на горелке или
плитке, пока раствор не станет прозрачным. После этого продолжают нагревание еще в течение 30
мин. В конце минерализации, когда вся вода испарится, прибавляют 1-2 капли пергидроля и
продолжают нагревание в течение 10 мин до обесцвечивания раствора. Отгон титруют раствором
хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л).
Параллельно проводят контрольный опыт.
Разность между количеством миллилитров раствора хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л)
в испытуемом и контрольном опытах, умноженная на 0,14 г, соответствует количеству миллиграммов
азота во взятой навеске. Принимая содержание азота в белке равным 16%, по количеству найденного
азота рассчитывают количество белка в опытной пробе.
2. Определение белка с реактивом Несслера
Навеску препарата, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в
микрометоде Кьельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.
0,5-1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10
мл воды, 2 мл реактива Несслера и доводят объем раствора водой до метки. Через 15 мин измеряют
оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10
мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах концентраций от 30 до 60 мкг азота с использованием
в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе
над серной кислотой.
Принимая содержание азота в белке равным 16%, по количеству найденного азота
рассчитывают количество белка в опытной пробе.
Примечания. Приготовление биуретового реактива: 0,75 г меди сульфата и 3 г натрия - калия
тартрата растворяют в 250 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, затем при энергичном
перемешивании прибавляют 150 мл 10% раствора натра едкого, свободного от углекислоты, 1 г калия
йодида, перемешивают и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор хранят в емкости из полиэтилена.
Приготовление реактива Бенедикта. 17,3 г натрия цитрата и 10 г натрия карбоната безводного
растворяют при нагревании в 50 мл воды (не доводя до кипения), прибавляют 10 мл 17,3% раствора
меди сульфата, перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и
доводят объем раствора водой до метки.
Приготовление 17,3% раствора меди сульфата: 17,3 г меди сульфата растворяют в воде в мерной
колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
Приготовление реактива I: состоит из двух растворов.
1. 4 г натра едкого растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 20 г натрия
карбоната и доводят объем раствора водой до метки.
2. 1 г меди сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем
раствора водой до метки; 2 г натрия тартрата (ГОСТ 5845-79, ч. д. а.) или натрия цитрата растворяют
в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Оба раствора
сливают при перемешивании.
Реактивом I служит смесь 49 мл раствора 1 и 1 мл раствора
2. Готовят перед употреблением.
Приготовление реактива II. 1 мл раствора 2 помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и
доводят 2% раствором натрия карбоната до метки.
Приготовление 2% раствора натрия карбоната: 2 г натрия карбоната помещают в мерную колбу
вместимостью 100 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора до метки водой.
Приготовление 1% раствора натрия дезоксихолата:
1 г натрия дезоксихолата (ТУ 6-09-10-1292-78) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью
100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
Приготовление реактива Бредфорд: 0,05 г кумасси ярко - голубого G-250 растворяют в мерной
колбе вместимостью 500 мл в 25 мл 95% спирта, прибавляют 50 мл 85% раствора кислоты
ортофосфорной и доводят объем раствора водой до метки.
Раствор хранят в сосуде из оранжевого стекла не более 10 сут.
Приготовление раствора кумасси ярко - голубого G-250: 0,06 г кумасси ярко - голубого G-250
растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в растворе хлористоводородной кислоты (0,6
моль/л) и доводят объем раствора той же кислотой до метки, фильтруют. Оптическая плотность
полученного раствора при длине волны 465 нм должна быть не менее 1,3 и не более 1,5.
Приготовление раствора бромфенолового синего:
0,0075 г бромфенолового синего водорастворимого (ТУ 6-09-3719-83) растворяют в мерной
колбе вместимостью 100 мл в 15 мл 95% спирта, прибавляют 2,5 мл ледяной уксусной кислоты,
перемешивают и доводят объем раствора водой до метки.
Приготовление натрий - цитратного буферного раствора рН 5,0: в колбу вместимостью 1 л
помещают 400 мл воды, 5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, 41,7 г натрия
цитрата, перемешивают при нагревании до полного растворения, затем прибавляют 1 г фенола,
перемешивают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят объем
раствора водой до метки.
Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. С в течение 15 сут.
Приготовление нингидринового реактива: в сосуд из оранжевого стекла вместимостью 1 л
помещают 375 мл монометилового эфира этиленгликоля (ТУ 6-09-08-4398-77), прибавляют 125 мл
натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5, при перемешивании на магнитной мешалке
пропускают азот в течение 10 мин, затем прибавляют 10 г нингидрина и вновь пропускают азот в
течение 10 мин, продолжая перемешивание на магнитной мешалке до полного растворения
нингидрина. После этого прибавляют 0,19 г олова двухлористого 2-водного и перемешивают.
Хранят реактив в сосуде из оранжевого стекла при температуре от 4 до 10 град. С не более 15
сут.
Приготовление натрий - ацетатного буферного раствора рН 5,5: 82 г натрия ацетата плавленого
(ТУ 6-09-246-70) растворяют при перемешивании в мерной колбе вместимостью 250 мл в 140 мл
воды, прибавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора водой до метки.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИНКА В ПРЕПАРАТАХ ИНСУЛИНА
Спектрофотометрический метод. В две мерные колбы вместимостью 50 мл помещают: в одну - 5
мл препарата или раствора инсулина, или 1,5 мл надосадочной жидкости (для суспензии инсулина),
в другую - 5 мл разбавленного раствора стандартного образца цинка. В каждую колбу прибавляют по
10 мл буферного раствора (рН 9,0), 3 мл раствора цинкона и доводят объем растворов водой до
метки. Растворы перемешивают и через 1 ч измеряют оптическую плотность на спектрофотометре
при длине волны 620 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором,
приготовленным с теми же реактивами.
Содержание цинка (X) в препарате или надосадочной жидкости в миллиграммах на 100 ЕД
инсулина вычисляют по формуле:
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
D1 х 0,001 х 50 х 2,5
Х = ----------------------
D0 х V
где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора препарата или надосадочной жидкости; D0 -
оптическая плотность разбавленного раствора стандартного образца цинка; 0,001 - содержание цинка
в миллиграммах в 1 мл измеряемого разбавленного раствора стандартного образца цинка; 2,5 -
количество препарата в миллилитрах, содержащего 100 ЕД инсулина (при содержании инсулина 40
ЕД в 1 мл препарата); V - объем препарата, раствора инсулина или надосадочной жидкости в
миллилитрах, взятых для анализа.
Примечания. 1. Приготовление раствора инсулина: навеску инсулина, содержащую 400 ЕД,
растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) в мерной колбе вместимостью 10
мл и доводят объем раствора этим же раствором хлористоводородной кислоты до метки.
2. Приготовление надосадочной жидкости суспензии: содержание флакона (5 мл) тщательно
перемешивают, вносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью
4000-6000 об/мин.
3. Приготовление раствора стандартного образца цинка: 0,4400 г цинка сульфата растворяют в
мерной колбе вместимостью 1 л в небольшом количестве свежепрокипяченной и охлажденной воды
и доводят объем раствора этой же водой до метки. Раствор стандартного образца цинка содержит 0,1
мг цинка в 1 мл.
Срок годности раствора 14 сут, хранение при температуре 4 - 8 град. С.
4. Приготовление разбавленного раствора стандартного образца цинка: 10 мл раствора
стандартного образца цинка помещают в колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора
свежепрокипяченной и охлажденной водой до метки. Разбавленный раствор стандартного образца
цинка содержит 0,01 мг цинка в 1 мл.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
5. Приготовление раствора борной кислоты (0,2 моль/л) с калия хлоридом. 12,3670 г
перекристаллизованной борной кислоты и 14,9110 г калия хлорида растворяют в
свежепрокипяченной и охлажденной воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем
раствора этой же водой до метки.
Срок годности раствора 30 сут, хранение при температуре 4 - 8 град. С.
6. Приготовление буферного раствора рН 9,0 (потенциометрически): 50 мл раствора борной
кислоты (0,2 моль/л) с калия хлоридом помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляют
21,3 мл раствора натра едкого (0,2 моль/л) и доводят объем раствора свежепрокипяченной и
охлажденной водой до метки.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
7. Приготовление раствора цинкона: 0,13 г цинкона (ТУ-6-0907-315-85 или фирмы "Хемапол",
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.
ЧССР) растирают в ступке с 2 мл раствора натра едкого (1 моль/л), количественно переносят в
мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора свежепрокипяченной и охлажденной
водой до метки и фильтруют.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
Определение цинка в препаратах инсулина с протамином. 5 мл тщательно перемешанного
препарата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и
перемешивают; 5 мл полученного раствора и 5 мл разбавленного раствора стандартного образца
цинка помещают в две другие мерные колбы вместимостью по 50 мл. В каждую колбу прибавляют по
1 мл раствора хлористоводородной кислоты (0,1 моль/л), 10 мл буферного раствора (рН 9,0), 1 мл
раствора натра едкого (0,1 моль/л) и 2 мл 0,01% раствора трипсина. Растворы перемешивают и
выдерживают 10 мин при комнатной температуре, затем в каждую колбу приливают по 3 мл
раствора цинкона и доводят объем раствора водой до метки. Полученные растворы перемешивают и
через 1 ч измеряют оптическую плотность, как указано выше.
Содержание цинка (X) в препарате в миллиграммах на 100 ЕД инсулина вычисляют по формуле:
D1 х 0,001 х 50 х 2,5 х 50
Х = ----------------------------
D0 х 5 х 5
где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора препарата; Dо - оптическая плотность
разбавленного раствора стандартного образца цинка; 0,001 - содержание цинка в миллиграммах в 1
мл измеряемого разбавленного раствора стандартного образца цинка; 2,5 - количество препарата в
миллилитрах, содержащего 100 ЕД инсулина (при содержании инсулина 40 ЕД в 1 мл препарата).
Примечания. 1. Приготовление 0,01% раствора трипсина: 0,01 г трипсина растворяют в
растворе хлористоводородной кислоты (0,001 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл и
доводят объем раствора этим же раствором хлористоводородной кислоты до метки.
Раствор должен быть свежеприготовленным.
2. Приготовление раствора хлористоводородной кислоты (0,001 моль/л): 100 мл раствора
хлористоводородной кислоты (0,01 моль/л) точно отмеривают из бюретки в мерную колбу
вместимостью 1 л. Объем раствора в колбе доводят водой до метки.
Срок годности раствора 6 мес.
Метод атомной абсорбции. Определение цинка в препаратах инсулина проводят на атомно -
абсорбционных спектрофотометрах при длине волны 214 нм в соответствии с ГФ XI (вып. 1, с. 42).
Цинк в инсулине. Готовят раствор инсулина в хлористоводородной кислоте (0,01 моль/л) с
содержанием 1 мг инсулина в 1 мл и проводят определение.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей
Приладожья, Поморья и Прионежья –
Постоянно действующий третейский суд.