Файл: Методическое обеспечение лабораторной диагностики вирусного гепатита В.rtf
Добавлен: 29.10.2023
Просмотров: 269
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
СОДЕРЖАНИЕ
.1 Вирусные гепатиты и их возбудители
Вирусные гепатиты А и Е не имеют хронических форм болезни или хронического вирусоносительства.
.2 Функции печени и их недостаточность при гепатитах
1.2.1 Белково-синтетическая функция печени
.2.2 Роль печени в пигментном обмене
1.2.3 Параметры функционального состояния печени
Согласно действующей классификации ферменты делят на шесть главных классов:
2. Классификация вирусных гепатитов
Как полагают, этим списком далеко еще не исчерпываются все возбудители ВГ.
ВГС передается через контакт с кровью больного ВГС человека.
пользование одними иглами и шприцами с больным ВГС (при внутривенном введении наркотиков);
повторное или многократное использование игл в медицинской практике;
серьезные хирургические операции;
перинатальный (или вертикальный) путь передачи ВГС от инфицированной матери к ребенку;
переливание крови или ее продуктов;
заражение при нанесении татуировок, прокалывании тела (пирсинг);
ΣЕ=0,768; Е0,360=147 мм;
ΣС=313,2; 1Е = 147х1/0,360=408,3
F=313,2/0,768=407,12; 1т. 0,049 = 0,049х408= 19,9 мм;
F=3,6; 2т. 0,122 = 0,122х408 = 49,7 мм;
т. 0,238 = 0,238х408 = 97,1 мм;
т. 0,359 = 0,359х408 = 146,7 мм.
Нормальные величины. Содержание общего билирубина - 8,55 - 20,52 мкмоль/л. Из него 75% приходится на долю непрямого.
Примечания
1. Сыворотка не должна быть гемолизирована.
2. Перед определением билирубина обследуемый человек не должен принимать лекарства и пищу, которые вызывают искусственное окрашивание сыворотки (морковь, апельсин), а также витамин «С».
5.2 Метод определения активности аспартатаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) в сыворотке крови динитрофенилгидразиновым методом (по Райтману, Френкелю, 1957)
Принцип метода
Аспартатаминотрансфераза (L-аспартат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.1.) катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов и 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.
Реактивы
1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый 2 ммоль/л
2. 2,4 - динитрофинилгидразин раствор 1 ммоль/л в НСl 1 моль/л
. Натрий гидроокись
. Субстрат АсАТ:
фосфатный буфер 0,1 моль/л
L-аспартат0,1 моль/л
2-оксаглуторат 2 ммоль/л
. 0,9% р-р NaCl
Приготовление рабочего раствора
Раствор гидроокиси натрия
В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3. Раствор устойчив.
Ход определения
| Ингредиенты (мл) | Проба | Контрольный раствор |
| Субстратный раствор АсАТ | 0,5 | 0,5 |
| Физиологический раствор | - | 0,1 |
| Предварительно инкубируют в течении 3 мин при 37°С | ||
| Сыворотка крови | 0,1 | - |
| Перемешивают, инкубируют точно 60 мин при 37°С | ||
| 2,4 - ДНФГ | 0,5 | 0,5 |
| Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при температуре (от + 15°С до +25°С) | ||
| 0,4н NaOH | 5,0 | 5,0 |
Перемешивают, выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Колориметрируют при длине волны 530 нм в кювете 1х1 мм, против холостой пробы.
Калибровка
В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и через 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.
| Раствор № | Физиологический раствор (мл) | Реактив 4 (мл) | Реактив 1 (мл) | Реактив 2 (мл) | Раствор NaOH | Конечная кат. конц. (мккат/л) | |
| 1 | 0,10 | 0,50 | - | 0,50 | 5,00 | 0 | |
| 2 | 0,10 | 0,45 | 0,05 | 0,50 | 5,00 | 0,28 | |
| 3 | 0,10 | 0,40 | 0,10 | 0,50 | 5,00 | 0,56 | |
| 4 | 0,10 | 0,35 | 0,15 | 0,50 | 5,00 | 0,83 | |
| 5 | 0,10 | 0,30 | 0,20 | 0,50 | 5,00 | 1,11 | |
Расчет
По оптической плотности пробы в калибровочном графике находят концентрацию фермента.
Предупреждение
Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре (от +2 до +8)°С в течении одной недели.
При каталитической концентрации фермента свыше 0,56 мккат/л анализ проводят с сывороткой, разбавленной физиологическим раствором (результат умножить на разведение).
| При кат. концентрации фермента | Разведение |
| (0,56 - 0,70) | 3х |
| (0,70 - 0,80) | 5х |
| (0,80 - 1,00) | 10х |
| (1,00 - 1,20) | 30х |
| Свыше 1,20 | 50х |
Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках диабетиков) вызывает повышение активности ферментов АсАТ и АлАТ. В таких случаях необходимо вычесть из оптической плотности пробы оптическую плотность сывороточного контрольного раствора. Сывороточный контрольный раствор приготавливают точно так же, как и пробу, с той лишь разницей, что сыворотку добавляют в пробирку после реактива 2.
Гемолиз повышает каталитическую концентрацию ферментов АсАТ и АлАТ. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства (сапонаты).
Референтные величины
АсАТ (мккат/л) 0,06-0,14
Предельные величины 0,42
5.3 Метод определения активности аланинаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) в сыворотке крови динитрофенилгидразиновым методом (по Райтману, Френкелю, 1957)
Принцип метода
Аланинаминотрансфераза (L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.2.) катализирует реакцию между
L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов и 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.
Реактивы
1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый 2 ммоль/л;
2. 2,4 - динитрофинилгидразин раствор 1 ммоль/л в НСl 1 моль/л;
3. Натрий гидроокись;
4. Субстрат АлАТ:
фосфатный буфер 0,1 моль/л;
DL-альфа-аланин 0,2 моль/л;
2-оксаглуторат 2 ммоль/л;
. 0,9% р-р NaCl.
Приготовление рабочего раствора
Раствор гидроокиси натрия
В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3. Раствор устойчив.
Ход определения
| Ингредиенты (мл) | Проба | Контрольный раствор |
| Субстратный раствор АлАТ | 0,5 | 0,5 |
| Физиологический раствор | - | 0,1 |
| Предварительно инкубируют в течении 3 мин при 37°С | ||
| Сыворотка крови | 0,1 | - |
| Перемешивают, инкубируют точно 60 мин при 37°С | ||
| 2,4 - ДНФГ | 0,5 | 0,5 |
| Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при температуре (от + 15°С до +25°С) | ||
| 0,4н NaOH | 5,0 | 5,0 |
Перемешивают, выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Колориметрируют при длине волны 530 нм в кювете 1х1 мм, против холостой пробы.
Калибровка
В обозначенные пробирки вносят пипеткой отдельные растворы в вышеприведенном порядке. После добавления реактива 2 содержимое пробирок перемешивают и через 20 мин добавляют раствор NaOH. Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора №2-5 против раствора №1. строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.
| Раствор № | Физиологический раствор (мл) | Реактив 4 (мл) | Реактив 1 (мл) | Реактив 2 (мл) | Раствор NaOH | Конечная кат. конц. (мккат/л) | |
| 1 | 0,10 | 0,50 | - | 0,50 | 5,00 | 0 | |
| 2 | 0,10 | 0,45 | 0,05 | 0,50 | 5,00 | 0,28 | |
| 3 | 0,10 | 0,40 | 0,10 | 0,50 | 5,00 | 0,56 | |
| 4 | 0,10 | 0,35 | 0,15 | 0,50 | 5,00 | 0,83 | |
| 5 | 0,10 | 0,30 | 0,20 | 0,50 | 5,00 | 1,11 | |