Файл: ЗападноКазахстанский медицинский университет имени Марата Оспанова Методика выделения днк коммерческим набором Дисциплина Медицинская генетика в онкологии. Исполнила Молдабекова Аягз Мейрамбекызы Актобе, 2022 год.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 07.11.2023
Просмотров: 103
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Западно-Казахстанский медицинский университет имени Марата Оспанова Методика выделения ДНК коммерческим наборомДисциплина: “Медицинская генетика в онкологии.”Исполнила: Молдабекова Аягөз МейрамбекқызыАктобе, 2022 год.План:1. Общие понятия о дезоксирибонуклеиновых кислотах2. Способы получения ДНК3. Химический состав и физико-химические свойства ДНК4. Методы количественного и качественного определения и исследования5. Содержание в клетках и тканях6. Биосинтез7. Биологическая роль8. Гистохимические методы обнаружения в тканяхЗаключениеЛитератураВведение. Существует два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая.Важные открытия были сделаны учеными, они открыли молекулу ДНК. На основе этой молекулы строится вся жизнь.Немного из истории. ДНК впервые были открыты Мишером (F. Micscher, 1869), который назвал полученное вещество нуклеином (лат. nucleus ядро). Впоследствии было показано, что нуклеин представляет собой высокомолекулярную, содержащую фосфор кислоту, находящуюся в комплексе с белками, поэтому стали различать собственно нуклеиновую кислоту [Альтманн (R. Altmann), 1889] и ее комплексы с белками — нуклеопротеиды. Вскоре нуклеиновая кислота была получена из вилочковой железы (тимуса) теленка, оказавшейся богатым источником итого вещества. Вещество, близкое но свойствам, но отличающееся от нуклеиновой кислоты, полученной из тимуса, выделили из дрожжей. Выяснилось, что нуклеиновая кислота из дрожжей содержит аденин, гуанин, цитозин и урацил, тогда как нуклеиновая кислота. выделенная из тимуса теленка, вместо урацила содержит тимин. В качестве углеводного компонента в дрожжевой нуклеиновой кислоте нашли пентозу, а в препарате из тимуса — дезоксипентозу. В зависимости от источника получения эти нуклеиновые кислоты получили названия тимонуклеиновой и зимонуклеиновой. Поскольку первый тип нуклеиновой кислоты находили в животных объектах, а второй — в растительных, употребляли также названия «животная» и «растительная» нуклеиновые кислоты. Однако, когда Фейльген (R. Feulgen) разработал гистохимическую реакцию на «животную» нуклеиновую кислоту, оказалось, что она обнаруживается в ядре как животных, так и растительных клетоколо С другой стороны, «дрожжевая» нуклеиновая кислота была найдена Ж. Браше главным образом в цитоплазме клеток и растений, и животных. Наконец, А. Н. Белозерским наличие ДНК у растений было доказано химически. Названия «дезоксирибонуклеиновая кислота» (ДНК) и «рибонуклеиновая кислота» (РНК) были предложены после того, как Левином (Р.A. Levenе) было установлено, что дезоксипентоза в тимонуклеиновой кислоте является дезоксирибозой, а пентоза в зимонуклеиновой кислоте — рибозой.
Дезоксирибонуклейновые кислоты (ДНК; устаревшие названия: дезоксипентозонуклеиновые кислоты, ядерные нуклеиновые кислоты, тимонукленновые кислоты, животные нуклеиновые кислоты) — нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента дезоксприбозу, а в качестве одного из пиримидиновых оснований — тимин, которым в молекулах рибонуклеиновых кислот соответствуют рибоза и урацил. ДНК представляют собой линейные полимеры дезоксирибонуклеотидов, в последовательности азотистых оснований которых закодирована вся наследственная информация.Таким образом, ДНК данного организма содержит в себе информацию о всех признаках вида и особенностях индивидуума — его генотип — и передает эту информацию потомству, воспроизводя определенную последовательность оснований в строении индивидуальных ДНК. Поскольку молекулы ДНК очень больших размеров и существует огромное множество возможных неодинаковых последовательностей из четырех различных нуклеотидов, число разных молекул ДНК практически бесконечно.В природе ДНК содержатся во всех организмах за исключением РНК-содержащих вирусов. ДНК являются типичным компонентом клеточного ядра, в котором они находятся в комплексе с белками, главным образом гистонами, образуя дезоксприбонуклеопротеиды, составляющие основу цитологической структуры хроматина и вещества хромосом. ДНК обнаружена также в хлоропластах растительной клетки и в митохондриях животных и растений, в которых она кодирует часть белков этих структур, благодаря чему они обладают некоторой автономией и лишь частично зависят от ДНК ядра.Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализациюгенетической программы развития и функционирования живых организмов.В большинстве случаев макромолекула ДНК состоит из двух цепей,ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечнаямолекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название«двойной спирали». Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатови сахаров [11]. Внутри одной цепи ДНК соседние нуклеотиды соединеныфосфодиэфирными связями, которые формируются в результатевзаимодействия между 3'-гидроксильной группой молекулы дезоксирибозыодного нуклеотида и 5'-фосфатной группой другого. Асимметричные концы
цепи ДНК называются 3' и 5'. Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путѐм присоединения новыхнуклеотидов к свободному 3'-концу). В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований. Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности.Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию оразличных типах РНК, наиболее важными из которых являютсяинформационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные.Исходя из структуры молекул, основания, входящие в составнуклеотидов, разделяют на две группы: пурины (аденин и гуанин) образованысоединѐнными пяти- и шестичленным гетероциклами; и пиримидины (цитозини тимин) — шестичленным гетероциклом. В двойной спирали различают малую и большую бороздки . Белки и факторы транскрипции обычно взаимодействуют с основаниями, расположенными в большой бороздке.Воспроизведение молекулы ДНК основано на том, что каждая цепьдвойной спирали служит матрицей для сборки новых молекул. Открытие ДНК,как и практически все великие открытия, не было результатом работыодинокого гения, а увенчало собой длинную цепь экспериментальных работ .Например,эксперимент Херши—Чейза продемонстрировал, чтоносителем генетической информации в клетках является именно ДНК, а небелки. Еще в 1920-е годы американский биохимик Фибус Левин (PhoebusLevene) установил, что основа ДНК, — это пятиатомный сахар дезоксирибоза;фосфатная группа и четыре азотистых основания. В конце 1940-х годовамериканский биохимик Эрвин Чаргафф выяснил, что во всех ДНК содержитсяравное количество оснований Т и А и, аналогично, равное количествооснований Г и Ц, процент соотношения Т\А и Г\Ц является важнейшей видо-специфичной характеристикой. 2. Способы получения ДНК.Выделение ДНК и РНК — необходимый шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Многие биохимическиепроцессы, такие как амплификация, проведение обратной транскрипции,сиквенс, гибридизация, синтез ДНК, не могут быть выполненынепосредственно на биологических образцах без предварительного выделения и
очистки нуклеиновых кислот. Существует несколько общепризнанных методовполучения ДНК из биологического материала, и в зависимости от поставленнойзадачи нужно выбрать наиболее оптимальную методику. При выборенужно помнить про несколько требований, предъявляемых к конечномурезультату, например - высокий выход нужного материала; время, требуемоедля получения конечного продукта; высокое качество полученного материала.В литературе описано множество методов, позволяющих выделятьнуклеиновые кислоты из разнообразных биологических материалов, однако невсе пригодны для автоматизации этого процесса, более того на многих стадияхвыделения присутствует высокий риск контаминации полученного препарата.. Методы выделения ДНК можно разделить на жидко - и твердофазные методы.Жидкофазные методы применяются когда требуется лизисбиологического материала (например кровь или ткань) детергентами илихаотропными веществами. После стадии лизиса следует несколько стадий вкоторых применяют органические растворители (фенол, хлороформ илиэтанол). При помощи перхлората натрия можно достигнуть полногоразделения белков и нуклеиновых кислот. Стандартная методика получениячистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и нерастворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНКиспользуется фенол-хлороформная экстракция. При перемешиванииклеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней(водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе .В этом способе присутствует несколько стадий центрифугирования ижидкостной экстракции, поэтому данный способ нельзя автоматизировать.Существует несколько методов, согласно которым из одного образцаможно выделить одновременно ДНК и РНК . При этом используютсясильные хаотропные агенты, такие как гуанидин тиоцианат и цезия три-флуороацетат для одновременного разрушения клеточныхмембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). Лимитирующими фак-торами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования ибольшое время анализа(16–44 ч).В твердофазных методах выделения нуклеиновых кислот используются следующие процессы и принципы: водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей; ионообмен в водном растворе; аффинность; механизмы исключения по размеру. Твердофазные системы, адсорбирующие нуклеиновые кислоты, — это частицы на основе кварца, стеклянные волокна, анионообменные носители ,которые используются в хромато- графических сепарационных колонках. Очень удобным является метод выделения нуклеиновых кислот, предложенный Santosa . Этот метод включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и
В зависимости от того, из какого организма выделяют ДНК используют различные методы разрушения клеток: 1. Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий разрушающие клеточную стенку бактерий – ЭДТА, лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или гуанидинизотиоцианат. 2. Разрушение клеток животных и человека не вызывает сложностей: используют используют гомогенизацию гомогенизацию, обработку обработку SDS, либо клетки обрабатывают протеиназами. 3. Для разрушения клеточных стенок растений Для разрушения клеточных стенок растений – ферменты ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. Часто используют обработку детергентами, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующими агентами, подавляющих действие клеточных нуклеаз за подавляющих действие клеточных нуклеаз за счет связывания двухвалентных катионов. Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.Препараты ДНК, получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь — от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз. После удаления основной массы белков препараты дополнительно депротеинизируют хлороформом с октанолом или фенолом. Нередко их обрабатывают также рибонуклеазами и протеолитическими ферментами, обычно проназой. Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы 0,15 М Nad, содержащим 0,015 М цитрат натрия, лизисе клеток при 60° и рН 8,0 в 0,15 М NaCI, содержащем ЭДТА и 2% додецилсульфат натрия, депротепнизации их хлороформом, содержащим изоамиловый спирт, переосаждении спиртом, повторной многократной депротеинизации, обработке рибонуклеазой и осаждении изопропиловым спиртом. Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.
Дезоксирибонуклейновые кислоты (ДНК; устаревшие названия: дезоксипентозонуклеиновые кислоты, ядерные нуклеиновые кислоты, тимонукленновые кислоты, животные нуклеиновые кислоты) — нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента дезоксприбозу, а в качестве одного из пиримидиновых оснований — тимин, которым в молекулах рибонуклеиновых кислот соответствуют рибоза и урацил. ДНК представляют собой линейные полимеры дезоксирибонуклеотидов, в последовательности азотистых оснований которых закодирована вся наследственная информация.Таким образом, ДНК данного организма содержит в себе информацию о всех признаках вида и особенностях индивидуума — его генотип — и передает эту информацию потомству, воспроизводя определенную последовательность оснований в строении индивидуальных ДНК. Поскольку молекулы ДНК очень больших размеров и существует огромное множество возможных неодинаковых последовательностей из четырех различных нуклеотидов, число разных молекул ДНК практически бесконечно.В природе ДНК содержатся во всех организмах за исключением РНК-содержащих вирусов. ДНК являются типичным компонентом клеточного ядра, в котором они находятся в комплексе с белками, главным образом гистонами, образуя дезоксприбонуклеопротеиды, составляющие основу цитологической структуры хроматина и вещества хромосом. ДНК обнаружена также в хлоропластах растительной клетки и в митохондриях животных и растений, в которых она кодирует часть белков этих структур, благодаря чему они обладают некоторой автономией и лишь частично зависят от ДНК ядра.Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализациюгенетической программы развития и функционирования живых организмов.В большинстве случаев макромолекула ДНК состоит из двух цепей,ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечнаямолекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название«двойной спирали». Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатови сахаров [11]. Внутри одной цепи ДНК соседние нуклеотиды соединеныфосфодиэфирными связями, которые формируются в результатевзаимодействия между 3'-гидроксильной группой молекулы дезоксирибозыодного нуклеотида и 5'-фосфатной группой другого. Асимметричные концы
цепи ДНК называются 3' и 5'. Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путѐм присоединения новыхнуклеотидов к свободному 3'-концу). В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований. Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности.Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию оразличных типах РНК, наиболее важными из которых являютсяинформационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные.Исходя из структуры молекул, основания, входящие в составнуклеотидов, разделяют на две группы: пурины (аденин и гуанин) образованысоединѐнными пяти- и шестичленным гетероциклами; и пиримидины (цитозини тимин) — шестичленным гетероциклом. В двойной спирали различают малую и большую бороздки . Белки и факторы транскрипции обычно взаимодействуют с основаниями, расположенными в большой бороздке.Воспроизведение молекулы ДНК основано на том, что каждая цепьдвойной спирали служит матрицей для сборки новых молекул. Открытие ДНК,как и практически все великие открытия, не было результатом работыодинокого гения, а увенчало собой длинную цепь экспериментальных работ .Например,эксперимент Херши—Чейза продемонстрировал, чтоносителем генетической информации в клетках является именно ДНК, а небелки. Еще в 1920-е годы американский биохимик Фибус Левин (PhoebusLevene) установил, что основа ДНК, — это пятиатомный сахар дезоксирибоза;фосфатная группа и четыре азотистых основания. В конце 1940-х годовамериканский биохимик Эрвин Чаргафф выяснил, что во всех ДНК содержитсяравное количество оснований Т и А и, аналогично, равное количествооснований Г и Ц, процент соотношения Т\А и Г\Ц является важнейшей видо-специфичной характеристикой. 2. Способы получения ДНК.Выделение ДНК и РНК — необходимый шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Многие биохимическиепроцессы, такие как амплификация, проведение обратной транскрипции,сиквенс, гибридизация, синтез ДНК, не могут быть выполненынепосредственно на биологических образцах без предварительного выделения и
очистки нуклеиновых кислот. Существует несколько общепризнанных методовполучения ДНК из биологического материала, и в зависимости от поставленнойзадачи нужно выбрать наиболее оптимальную методику. При выборенужно помнить про несколько требований, предъявляемых к конечномурезультату, например - высокий выход нужного материала; время, требуемоедля получения конечного продукта; высокое качество полученного материала.В литературе описано множество методов, позволяющих выделятьнуклеиновые кислоты из разнообразных биологических материалов, однако невсе пригодны для автоматизации этого процесса, более того на многих стадияхвыделения присутствует высокий риск контаминации полученного препарата.. Методы выделения ДНК можно разделить на жидко - и твердофазные методы.Жидкофазные методы применяются когда требуется лизисбиологического материала (например кровь или ткань) детергентами илихаотропными веществами. После стадии лизиса следует несколько стадий вкоторых применяют органические растворители (фенол, хлороформ илиэтанол). При помощи перхлората натрия можно достигнуть полногоразделения белков и нуклеиновых кислот. Стандартная методика получениячистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и нерастворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНКиспользуется фенол-хлороформная экстракция. При перемешиванииклеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней(водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе .В этом способе присутствует несколько стадий центрифугирования ижидкостной экстракции, поэтому данный способ нельзя автоматизировать.Существует несколько методов, согласно которым из одного образцаможно выделить одновременно ДНК и РНК . При этом используютсясильные хаотропные агенты, такие как гуанидин тиоцианат и цезия три-флуороацетат для одновременного разрушения клеточныхмембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). Лимитирующими фак-торами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования ибольшое время анализа(16–44 ч).В твердофазных методах выделения нуклеиновых кислот используются следующие процессы и принципы: водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей; ионообмен в водном растворе; аффинность; механизмы исключения по размеру. Твердофазные системы, адсорбирующие нуклеиновые кислоты, — это частицы на основе кварца, стеклянные волокна, анионообменные носители ,которые используются в хромато- графических сепарационных колонках. Очень удобным является метод выделения нуклеиновых кислот, предложенный Santosa . Этот метод включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и
В зависимости от того, из какого организма выделяют ДНК используют различные методы разрушения клеток: 1. Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий разрушающие клеточную стенку бактерий – ЭДТА, лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или гуанидинизотиоцианат. 2. Разрушение клеток животных и человека не вызывает сложностей: используют используют гомогенизацию гомогенизацию, обработку обработку SDS, либо клетки обрабатывают протеиназами. 3. Для разрушения клеточных стенок растений Для разрушения клеточных стенок растений – ферменты ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. Часто используют обработку детергентами, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующими агентами, подавляющих действие клеточных нуклеаз за подавляющих действие клеточных нуклеаз за счет связывания двухвалентных катионов. Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.Препараты ДНК, получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь — от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз. После удаления основной массы белков препараты дополнительно депротеинизируют хлороформом с октанолом или фенолом. Нередко их обрабатывают также рибонуклеазами и протеолитическими ферментами, обычно проназой. Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы 0,15 М Nad, содержащим 0,015 М цитрат натрия, лизисе клеток при 60° и рН 8,0 в 0,15 М NaCI, содержащем ЭДТА и 2% додецилсульфат натрия, депротепнизации их хлороформом, содержащим изоамиловый спирт, переосаждении спиртом, повторной многократной депротеинизации, обработке рибонуклеазой и осаждении изопропиловым спиртом. Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.