Файл: ЗападноКазахстанский медицинский университет имени Марата Оспанова Методика выделения днк коммерческим набором Дисциплина Медицинская генетика в онкологии. Исполнила Молдабекова Аягз Мейрамбекызы Актобе, 2022 год.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 07.11.2023
Просмотров: 23
Скачиваний: 2
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
3. Химический состав и физико-химические свойства ДНК.
ДНК представляют собой многоосновные сильные кислоты, щелочные соли которых образуют в воде очень вязкие прозрачные коллоидные растворы, застывающие при концентрации выше 0,25%. Растворы ДНК характеризуются аномальной (структурной) вязкостью, объясняющейся удлиненной формой молекул, и в потоке обладают двойным, лучепреломлением. Химически ДНК представляют собой высокомолекулярные полимеры монодезоксирибонуклеотидов (мононуклеотидов), являющиеся мономерами, из которых построены молекулы ДНК. Каждый мононуклеотид ДНК состоит из остатков фосфорной кислоты, 2-П-дезоксирибозы и пуринового или пиримидинового азотистого основания. Углеводно-фосфатный остаток одинаков во всех мономерах ДНК, азотистое основание же может быть представлено аденином (А), гуанином (Г), цитозином (Ц) или тимином (Т). В ДНК разных организмов имеется некоторое количество так называемых, минорных оснований, например 5-метил-цитозина, частично заменяющего цитозин. У высших животных и человека содержание этого основания достигает 1,5%, у высших растений 5—7% , у бактерий — не более 0,6% . В ДНК бактерий встречается также 6-метиладенин и иногда другие метилированные азотистые основания. В ДНК Т-четных бактериофагов (Т2, Т4 и Т6) цитозин полностью замещен 5-оксиметилцитозином, в ДНК вирусов SP01 и SP8 тимин замещен 5-оксиметилурацилом, а у фага PBS1 — урацилом.
В мононуклоотидах 2-П-дезокси-рибоза присоединена гликозидной связью через первый углеродный атом к атому азота в 9-м положении пуринового основания (аденина или гуанина) или в 3-м положении пиримидинового основания (цитозина или тимина). Остаток фосфорной кислоты присоединен эфирной связью к 5'-му или З'-му атому углерода дезоксирибозы. Таким образом, мононуклеотидные остатки соединены между собой через фосфорную кислоту, которая соединена с 5'-С-атомом дезоксирибозы одного нуклеотида и с 3'-С-атомом дезоксирибозы соседнего нуклеотида и т. д.
4. Методы количественного и качественного определения и исследования.
Большинством цветных химических реакций ДНК обязаны своему углеводному компоненту — дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.
Чаще других реакций для обнаружения и количественного определения ДНК применяют нагревание с дифениламином в концентрированной уксусной кислоте в присутствии концентрированной серной кислоты. Эту реакцию обычно применяют в модификации Бертона (К. Burton) при 30° в присутствии уксусного альдегида. Реже применяются менее чувствительные цветные реакции с цистеином, с триптофаном или индолом, а также с карбазолом. Иногда применяют также цветную реакцию с ганитрофенилгидразином. Весьма чувствительным является флюориметрический метод, позволяющий определять до 3.10-9 г ДНК. Для количественного определения ДНК необходимо ее предварительное отделение от РНК и (по возможности) от других веществ, мешающих применяемой реакции. Для этих целей обычно пользуются методом Шмидта и Таннгаузера (G. Schmidt, S. J. Thannhauser) в различных модификациях. Принцип метода заключается в осаждении нуклеиновых кислот вместе с белками трихлоруксусной или хлорной кислотой,
отмывании кислоторастворимых фосфорных соединений, экстрагировании липидов и извлечении нуклеиновых кислот при помощи гидролиза 5% трихлоруксусной кислотой при 90° в течение 15—20 мин. Белки при этом остаются в осадке; из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты и подвергнутого гидролизу 0,3— 1,0 н. щелочью, вызывающей распад РНК до нуклеотидов, ДНК осаждают подкислением трихлоруксусной или хлорной кислотой. Осадок отмывают и ДНК экстрагируют горячей хлорной кислотой. Содержание ДНК определяют по фосфору, спектрофотометрически или при помощи специфических цветных реакций, но спекислотрофотометрический метод является наиболее простым и быстрым для определения ДНК после отделения ее от других веществ, характеризующихся максимумом поглощения при 260 нм.
5. Содержание в клетках и тканях.
Содержание ДНК в органах и тканях животных и человека колеблется в широких пределах и, как правило, тем выше, чем больше клеточных ядер приходится на единицу массы ткани. Особенно много ДНК (около 2,5% сырого веса) в вилочковой железе, состоящей главным образом из лимфоцитов с крупными ядрами. Довольно много ДНК в селезенке (0,7—0,9%), мало (0,05—0,08%) в мозге и мышцах, где ядерное вещество составляет значительно меньшую долю. На ранних стадиях эмбрионального развития в этих органах содержится больше ДНК, но содержание ее уменьшается в процессе онтогенеза по мере дифференцировки. Однако количество ДНК на одно клеточное ядро, содержащее диплоидный набор хромосом, практически постоянно для каждого биологического вида. Соответственно количество ДНК в ядрах половых клеток вдвое ниже. По этой же причине различные физиологические и патологические факторы почти не влияют на содержание ДНК в тканях, а при голодании, например, относительное содержание ДНК даже возрастает за счет снижения концентрации других веществ (белков, углеводов, липидов, РНК). У всех млекопитающих количество ДНК в диплоидном ядре почти одинаково и составляет около 6 1012 г, у птиц — около 2,5 10-12, у разных видов рыб, амфибий и простейших оно колеблется в значительных пределах.
Содержание ДНК в бактериях довольно велико и достигает нескольких процентов в пересчете на сухой вес; в вирусах оно может доходить до 50%. Вместе с тем абсолютное количество ДНК в бактериальной клетке в среднем на два порядка ниже, чем в клеточном ядре высших организмов, а в ДНК-содержащих вирусах оно ниже еще на два порядка.
У бактерий одна гигантская молекула ДНК образует генофор, соответствующий хромосоме высших организмов. Так, у кишечной палочки Escherichia coli молекулярный вес такой кольцеобразной двуспиральной молекулы достигает около 2,5-Ю9 и длины, превышающей 1,2 мм. Эта огромная молекула плотно упакована в небольшой «ядерной области» бактерии и соединена с бактериальной мембраной. В хромосомах высших организмов (эукариотов) ДНК находится в комплексе с белками, главным образом гистонами; в каждой хромосоме содержится, по-видимому, одна молекула ДНК длиной до нескольких сантиметров и молекулярным весом до нескольких десятков миллиардов. Такие огромные молекулы умещаются в клеточном ядре и в митотических хромосомах длиной в несколько микрометров. Часть ДНК остается не связанной с белками; участки несвязанной ДНК перемежаются с блоками ДНК, связанной с гистонами. Показано, что в таких блоках содержится по две молекулы гистонов 4 типов: Нда, Hab, Hg и Н4.
Помимо клеточного ядра, ДНК содержится в митохондриях и в хлоропластах. Количество такой ДНК обычно невелико и составляет небольшую долю общей ДНК клетки. Однако в ооцитах и на ранних стадиях эмбрионального развития животных подавляющая часть ДНК локализована в цитоплазме, главным образом в митохондриях. В каждой митохондрии содержится по поскольку молекул ДНК. У животных мол. вес митохондриальной ДНК составляет около 10-106; ее двуспиральные молекулы замкнуты в кольцо и находятся в двух основных формах: сверхскрученной и открытой кольцевой. В митохондриях и в хлоропластах ДНК не находится в комплексе с белками, она ассоциирована с мембранами и напоминает бактериальную ДНК Небольшие количества ДНК обнаружены также в мембранах и некоторых других структурах клеток, однако их особенности и биологического роль остаются неясными.
6. Биосинтез. В процессе биологического синтеза ДНК на матрице аналогичной молекулы ДНК образуется такая же молекула, и количество ДНК удваивается. Поэтому процесс биосинтеза ДНК получил название редупликации или репликации.
Принцип комплементарности (дополнительности), по Уотсону и Крику, заложен в самом строении: ДНК.
Дж. Уотсоном и Ф. Криком было постулировано, что репликация ДНК должна происходить полуконсервативным способом, то есть путем раскручивания двойной спирали и синтеза новых, комплементарных исходной полинуклеотидных цепочек на каждой нити. Именно этот механизм и был доказан экспериментально путем введения в ДНК-матрицу тяжелого азота (радиоактивной метки) и анализа ДНК последующих поколений при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия или методом авторадиографии.
ДНК синтезируется из дезоксинуклеозидтрифосфатов, которые соединяются в полинуклеотидную цепь с отщеплением пирофосфата. Эта реакция протекает на матрице одноцепочечной предобразованной ДНК под действием фермента ДНК-полимеразы, причем синтезирующаяся: дезоксирибополинуклеотидная цепь дочерней ДНК строго комплементарна матричной цепи. ДНК-полимераза, впервые выделенная из Е. coli, хорошо изучена. Ее молекулярный вес составляет 110 000 дальтонов, под действием трипсина она распадается на 2 фрагмента — активный и неактивный. Для протекания реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, необходимы матричная ДНК, обязательное присутствие всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и ионов Mg2+. Равновесие реакции сильно смещено в сторону синтеза, оптимальная величина рН 7,5; реакция ингибируется пирофосфатом: концентрация пирофосфата 2•10-3 М угнетает реакцию синтеза на 50%. Показано, что двуспиральная молекула ДНК неактивна в качестве матрицы, однако для инициации репликации на активной матрице одноцепочечной ДНК необходим участок комплементарной ей полинуклеотидной цепи со свободным 3'-ОН-кон-цом рибозы, служащий затравкой для роста вновь синтезирующейся цепи. Эта затравка состоит из рибонуклеотидных остатков, которые удаляются по завершении синтеза комплементарной цепи ДНК. К 3'-ОН-концу затравки ДНК-полимераза последовательно присоединяет дезокспрпбонуклеотидные остатки, соединяющиеся водородными связями с комплементарными основаниями матричной цепи. Рост синтезирующейся цепи происходит в направлении 3'-ОН — 3'-ОН-концам, антипараллельно матричной цепи. Репликация ДНК приводит к удвоению количества генетического материала клетки и, как правило,— к клеточному делению. Поэтому репликация происходит тем чаще, чем короче время генерации вируса или бактерии и чем чаще делятся клетки у высших организмов. Темп репликации высок у эмбрионов, в особенности во время дробления, и замедляется по мере развития и дифференцировки. Вообще темп репликации соответствует митотической активности ткани и поэтому низок в не делящихся клетках, например в клетках мозга пли мышц, и относительно высок в часто делящихся клетках костного мозга или опухолей. Репликация ДНК имеет место и при эндомптозах, приводящих к полиидоидизации ядер. Репликация происходит не во время собственно митоза, а в интеркинетической фазе во время синтетического S-периода клеточного цикла между периодами gi и Ga.
У бактерий и вирусов репликация начинается в одной точке молекулы ДНК. В каждой хромосоме высших организмов таких точек обычно бывает по нескольку сот. В точке начала синтеза ДНК могут образоваться одна пли две репликационные вилки. В первом случае репликация протекает в одном направлении; обычно же образуются две вилки, которые движутся по молекуле ДНК в противоположных направлениях. 'Такая двунаправленная репликация показана авторадиографическим методом на кольцевых ДНК бактерий, а также у высших организмов. По мере продвижения репликационных вилок образуются дочерние двуспиральные молекулы ДНК, состоящие наполовину из старых цепей и наполовину из комплементарных им новых цепей ДНК.
7. Биологическая роль. Цитогенетические исследования в 20—30-х гг. 20 в. свидетельствовали о том, что передача и хранение наследственных признаков связаны с хромосомами, находящимися в ядерном веществе. То, что наследственным веществом является именно ДНК, а не белок, стало ясным в результате исследований, проведенных в 40-х гг. 20 в. на бактериях и бактериофагах (см. Ген).
В 1944 г. Эйвери, Мак-Лауд и Мак-Карти (О. Т. Avery, С. М. Мас-Leod, М. McCarty) установили природу трансформирующего фактора у бактерий. Им оказалась ДНК. Процесс трансформации состоит, несомненно, из ряда стадий: обратимой сорбции молекул ДНК бактериальной клеткой; внедрения этих молекул внутрь клетки; интеграции молекулы чужой ДНК в хромосому клетки, расщепления образовавшейся сложной структуры и ее перехода в рекомбинанты. При исследовании бактериальных вирусов под электронным микроскопом пли при помощи радиоактивной метки, вводимой в белок или в ДНК бактериофага, было показано, что вирус, фиксируясь на поверхности бактериальной клетки, вводит в нее только молекулу ДНК, оставляя снаружи свою белковую оболочку. Молекула ДНК вируса, попавшая в клетку, несущая в себе всю наследственную информацию (геном) вируса, вызывает образование в клетке новых вирусных частиц, их размножение и гибель клетки от лизиса. Некоторые, так называемые умеренные, фаги у части бактериальных клеток не вызывают явных признаков заражения, однако их ДНК, попадая в клетку, прочно связывается с геномом самой бактерии, интегрируясь с ДНК бактериальной клетки. Многие поколения таких бактерий несут в себе бактериофаг в скрытом виде, не проявляя признаков нарушения жизнедеятельности. Однако при неблагоприятных условиях и при действии каких-либо повреждающих факторов, например ионизирующей или ультрафиолетовой радиации, вирус в таких бактериях начинает размножаться и вызывает лизис (гибель) бактерий. ДНК вируса настолько прочно связывается с ДНК бактерий, что заражение вирусом, полученным от лизогенных бактерий, сопровождается переносом вместе с ДНК вируса части ДНК бактерий, с которой передаются некоторые наследственные свойства этих бактерий, отсутствующие и у вновь заражаемых бактерий, и у самого вируса. Это явление, сходное с трансформацией, получило название трансдукции .