Файл: Практикум по физикохимическим методам в биотехнологии Учебнометодическое пособие Утверждено.pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 09.11.2023
Просмотров: 123
Скачиваний: 3
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет тонких химических технологий имени МВ. Ломоносова Кафедра биомедицинских и фармацевтических технологий
С.А. Кедик, И.П. Седишев, ДО. Шаталов Практикум по физико-химическим методам в биотехнологии
Учебно-методическое пособие Утверждено
Библиотечно-издательской комиссией
МИТХТ им. МВ. Ломоносова в качестве учебно- методического пособия по дисциплине Физико- химические методы исследования в биотехнологии для бакалавров, обучающихся по направлению 19.03.01 Биотехнология Москва
МИХТ им. МВ. Ломоносова
2015
С.А. Кедик, И.П. Седишев, ДО. Шаталов Практикум по физико-химическим методам в биотехнологии
Учебно-методическое пособие Утверждено
Библиотечно-издательской комиссией
МИТХТ им. МВ. Ломоносова в качестве учебно- методического пособия по дисциплине Физико- химические методы исследования в биотехнологии для бакалавров, обучающихся по направлению 19.03.01 Биотехнология Москва
МИХТ им. МВ. Ломоносова
2015
2
УДК 615.07
ББК 52.8 К Рецензент : д.х.н., проф. Зайцев Н.К. Рекомендовано к изданию кафедрой биомедицинских и фармацевтических технологий (протокол № 9 от 02.04.15) План издания МИТХТ ( поз № 195/15 ) К Кедик С.А., Седишев И.П., Шаталов ДО. Практикум по физико-химическим методам в биотехнологии. Учебно- методическое пособие. – М МИТХТ им. МВ. Ломоносова, 2015 – 92 с ил.
В учебно-методическом пособии изложены теоретические основы методов, используемых при анализе субстанций и лекарственных средств согласно ГФ. Практические работы охватывают важнейшие классы соединений и наиболее распространѐнные методы их анализа. Пособие предназначено студентам, обучающимся по направлению бакалавриата 19.03.01 Биотехнология, для получения ими практических навыков по дисциплине
«Физико-химические методы исследования в биотехнологии, которые проводятся на кафедре БМиФТ
©С.А. Кедик, И.П. Седишев, ДО. Шаталов
© МИТХТ им. МВ. Ломоносова, 2015
3 СОДЕРЖАНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ
4 2 Хроматографические и близкие к ним методы разделения и анализа
6 Работа 1. Количественное определение эмоксипина в глазных каплях
6 Работа 2. Разделение анионов методом капиллярного электрофореза
26 Работа 3. Определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле
41 3 Спектроскопические методы
54 Работа 4. Определение подлинности субстанции «Эноксопарин натрия и посторонних примесей в субстанции Гепарин натрия методом ЯМР
55 Работа 5. Определение содержания антоцианов методом рН-дифференциаль- ной спектрофотометрии
68 Работа 6. Определение цветности субстанции Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5. Работа
7. Определение удельного оптического вращения и количественное определение основного вещества в субстанции гидроксиэтилкрахмала поляриметрически.
78 80 4 Различные методы Работа 8. Определение характеристической вязкости субстанции гидроксиэтилкрахмала. Работа
9. Определение содержания таурина в таблетках или капсулах.
85 85 87
4 1 ВВЕДЕНИЕ Представленное пособие по дисциплине Физико- химические методы исследования в биотехнологии является частью направления Фармацевтический инжиниринг», которое разрабатывалось при поддержке Европейской организации по качеству (EOQ), специалистов Университета
Кренфилда Великобритания, Пражского химико- технологического института Чехия, международных фармацевтических предприятий
ННЕ
«Фармаплан»,
«Колоркон», отечественных предприятий ГУП НПО
«Микроген», ООО
«Научно-внедренческий центр
Агроветзащита», ОАО «Валента Фарм» и других. Такое сотрудничество способствовало сочетанию требований Государственной фармакопеи, федеральной целевой программы Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу ( постановление Правительства РФ от 17 февраля 2011 г. № 91 ) и других нормативных актов РФ и передового зарубежного опыта для обеспечения подготовки специалистов на кафедре БМиФТ. Особенность пособия состоит в том, что наряду с конкретными методиками анализа и контроля параметров фармацевтических продуктов, приводится минимальная теоретическая база использованного метода. Такой подход позволяет хотя бы частично компенсировать отсутствие учебника по изучаемому предмету. Кроме того, критерием отбора работ явилось их актуальное использование для научных и практических направлений деятельности кафедры. Сочетание навыков подготовки специалиста и включение его на ранних стадиях обучения в работу
5 самостоятельных направлений кафедры позволяет повысить мотивацию по приобретению знаний и навыков и способствовать их закреплению. Относительная самостоятельность и работа в небольшой группе по 2-3 студента делает обучение практически индивидуальным. Наличие современного парка аналитического оборудования кафедры и сотрудничество с фирмами «Колоркон», ЗАО Институт фармацевтических технологий, ООО
«Олфарма», ФГУП Московский эндокринный заводи других способствует освоению наиболее практически значимых подходов по контролю фармацевтической продукции и обеспечению передового уровня фармацевтического производства. Авторы выражают признательность Мотовилову Д.В.,
Ворфоломеевой Е.В., доценту Панову А.В. и профессору
Зайцеву Н.К. за ценные замечания и предоставленные материалы.
6
2 ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ И БЛИЗКИЕ К НИМ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА Работа 1. Количественное определение эмоксипина в глазных каплях. Теоретические основы метода Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos— цвет, краска) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении компонентов смеси между двумя фазами — неподвижной и подвижной (элюент, протекающей через неподвижную фазу, те. основу метода составляют процессы сорбции и десорбции. Метод впервые был применен для разделения окрашенных растительных пигментов – хлорфиллинов в г. русским ученым МС. Цветом (1872-1919). Хроматографический анализ является критерием однородности вещества если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают хроматографически чистым, однородным (без примесей. Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. Широкое распространение хроматографические методы получили благодаря своим достоинствам эффективности, простоте эксперимента, селективности, экспрессности, возможности автоматизации в сочетании с другими физико- химическими методами. Отличительная особенность хроматографических методов – их универсальность, те. возможность использования для разделения и определения
7 твѐрдых, жидких и газообразных органических и неорганических соединений в широком интервале концентраций. Ценность хроматографических методов состоит в том, что они позволяют эффективно проводить разделение соединений с близкими свойствами. Хроматография даѐт возможность проводить качественный и количественный анализ исследуемых объектов, изучать физико-химические свойства веществ, осуществлять контроль и автоматическое регулирование технологических процессов. В последнее время хроматография – один из основных методов контроля окружающей среды. Хроматографические методы разделения веществ основаны на сорбционных процессах. Под сорбцией понимают поглощение газов, паров или растворенных веществ твѐрдыми или жидкими поглотителями сорбентами. Сорбция – общее понятие, которое включает в себя адсорбцию (поглощение на поверхности фазы) и
абсорбцию (поглощение в объѐме фазы. Сущность всех хроматографических методов состоит в том, что разделяемые вещества перемещаются через слой неподвижного сорбента (неподвижной фазы) вместе с подвижной фазой (жидкой или газообразной) с разной скоростью вследствие различной сорбируемости. В процессе хроматографирования много раз повторяются процессы сорбции и десорбции компонентов в новых слоях сорбента, что обеспечивает высокую эффективность разделения. Любой сорбционный процесс характеризуется константой распределения (К
распред
), которая представляет
8 собой отношение равновесной концентрации вещества в неподвижной фазе (с) к его концентрации в подвижной фазе с.
К
распред
= с
∕ с Константа распределения зависит от природы определяемого вещества природы подвижной и неподвижной фаз температуры рН; концентрации и ионной силы раствора (в случае жидкостной хроматографии. Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твѐрдое тело с развитой поверхностью распределительная хроматография – на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесѐнная на твѐрдый макропористый носитель) и элюенте ионообменная хроматография — на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой ионитом) и компонентами разделяемой смеси
эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография – на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель. Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твѐрдой неподвижной фазе. В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают
• газовую хроматографию ГХ (GC)
• жидкостную хроматографию ВЭЖХ (HPLC). Колонки для ВЭЖХ В современной ВЭЖХ используют сорбенты с величиной зерна от 3 до 10 мкм.
9 Применение этих носителей стало возможно только после того, как для их применения были созданы соответствующие приборы и инструменты. Высокий стандарт качества и разнообразие предлагаемых сорбентов и готовых колонок в комбинации с эффективными приборами делают возможным быстрое проведение анализов с оптимальной селективностью и высокой чувствительностью. Эти параметры можно оптимизировать, варьируя размеры зерна, структуру пор, модифицируя сорбенты, размеры колонок и состав элюентов. На практике большинство проблем разделения можно решить с помощью небольшого числа сорбентов, если используют избирательность элюентов. Но для оптимизации определѐнных проблем разделения следует вернуться к модифицированным сорбентам со специфической селективностью, что позволит избежать больших затратна определение оптимальных условий разделения. Большое значение для разделяющей способности колонки имеют размер зерна и узкое распределение частиц сорбента по размерам. Вообще считается, что частицы меньших размеров позволяют достичь лучших хроматографических характеристик. Тем не менее, часто, используя частицы несколько больших размеров (например,
7 мкм вместо 5 мкм, добиваются приемлемой разделяющей способности колонок при более коротком времени анализов и более продолжительном времени жизни колонки. Еще одну возможность оптимизации представляет применение сорбентов с узким распределением частиц по размерам. Наряду с узким гранулометрическим составом сорбентов необходимо оптимальное заполнение ими колонок, а все хроматографические материалы для ВЭЖХ должны быть стабильны к давлению. Готовые колонки, полученные
10 промышленным способом, гарантируют очень высокий стандарт, и поэтому пользователь вряд ли будет самостоятельно заниматься заполнением колонок. Плохое и неравномерное заполнение колонок приводит, кроме всего прочего, к образованию каналов в структуре слоя сорбента, к его проседанию и т.д. Образующийся вследствие этого мѐртвый объѐм значительно ухудшает эффективность разделения или делает колонку непригодной. В соответствии с используемыми сорбентами методы разделения подразделяют на
•нормальнофазовую хроматографию (адсорбционная хроматография,
• обращѐннофазовую хроматографию,
• эксклюзионную хроматографию. За исключением эксклюзионной хроматографии эффект разделения в жидкостной хроматографии основывается на разной полярности стационарной и подвижной фазы.
Обращѐннофазовая хроматография Как видно уже из названия, здесь работают с противоположным соотношением полярностей, те. стационарная фаза – неполярная, а подвижная фаза – полярная. В этом случае силикагель модифицируется химически. Обращенные фазы получают, если поверхность силикагеля покрывают гидрофобными функциональными группами. Стабильнее всего соединения, в которых функциональная группа связана через ковалентную связь Si–
C, которая химически стабильна в области pH от 1 до 9. Наибольшее количество разделений в аналитике проводится в ВЭЖХ с модифицированными стационарными фазами. В зависимости от вида функциональной группы для обозначения колонок используют сокращения, указанные в таблице.
11 В качестве подвижной фазы используется вода, полярные органические растворители (метанол, ацетонитрил) или их смеси. Этим методом можно разделять широкий круг соединений, так как многие вещества растворимы вводе или подобных растворителях. Развитие техники обращѐннофазовой хроматографии (ОФХ) с химически связанными обращенными фазами позволило значительно расширить область применения ВЭЖХ. Более 70% анализов методом ВЭЖХ проводятся сегодня на химически связанных фазах. Принцип ОФХ представлен на рис. 1. Химически модифицированный алкильными группами силикагель образует неполярную стационарную фазу, подвижная фаза – полярная. Неполярные молекулы или соответственно неполярные группы в молекулах предпочтительнее удерживаются на неполярной стационарной фазе. Вода часто обозначается как самый сильный ( полярный ) элюент в хроматографии. Однако это справедливо только для адсорбционной хроматографии (нормальнофазовая): вода может вступать в очень сильное взаимодействие с активными центрами силикагеля и оксида алюминия, так что молекулы пробы больше не могут адсорбироваться и быстро элюируются. В ОФХ всѐ с точностью до наоборот вода не может смачивать аполярные (гидрофобные) алкильные группы и не вступает сними во взаимодействие. Поэтому в
12
ОФХ вода самая слабая из всех мобильных фаз и медленнее всего элюирует пробу. Чем больше содержание воды в элюенте, тем больше время удержания. Поэтому разделение на ОФ можно легко оптимизировать, варьируя состав подвижной фазы с возрастающим содержанием органического растворителя полярность подвижной фазы и, вместе стем, время удерживания уменьшается.
ОФ матрицы, C2, C4, C8, C18 и фенил, отличаются временем удерживания веществ. С ростом длины алкильных групп поверхность становится всѐ более неполярной. Как показано на рис. 2, время удерживания в тех же самых хроматографических условиях (подвижная фаза, скорость потока) для C18 (ОФ18, англ. RP18) для многих веществ примерно вдвое больше, чем для C8 (ОФ8, англ. RP8). Самое большое время удерживания получают при использовании сорбента C18 как самой неполярной стационарной фазы и воды как самой полярной подвижной фазы. Рис. 1. Характер взаимодействия фаз в ОФХ.
13 Механизм разделения, который лежит в основе ОФХ, – это притяжение за счѐт Ван-дер-Ваальсовых сил между углеводородными фрагментами молекул пробы и привитыми алкильными группами сорбента. Чем больше углеводородная часть в молекулах, тем сильней они притягиваются. Это различие в химической структуре молекул приводит к более сильной или более слабой их адсорбции на стационарной фазе и, вместе стем, к разделению. Вещества удерживаются
ОФ поверхностью тем сильней, чем меньше они растворимы вводе, те. чем более они неполярны. Полярные вещества элюируются раньше, чем неполярные. Рис. 2. Влияние типа ОФ сорбента на время удерживания.
14 Хотя привитые на поверхность силикагеля фазы представляют собой мономерный органический слой, они отличаются высокой поверхностной концентрацией функциональных групп. Она составляет от 3 до 4 функциональных групп на 100 A
2
. Так как привитой фазой невозможно закрыть абсолютно все силанольные группы, то различные производители пытаются осуществлять в дополнительной стадии модификации так называемое дозакрытие (англ. «endcapping»), чтобы модифицировать оставшиеся после первой обработки силанольные группы. Цель состоит в уменьшении активных центров на поверхности путѐм перевода активных силанольных групп в индифферентные группы. Пожалуй, наиболее широко используемым реагентом для дозакрытия является триметилхлорсилан. Различные стадии модификации силикагеля представлены на рис.
3. Часть а) показывает поверхность немодифицированного силикагеля. Поверхностные силанольные группы активны и вступают во взаимодействие с ионными и полярными соединениями. Часть б) показывает модифицированный, привитой силикагель. Однако преобразование поверхностей никогда не может быть полным. На поверхности остаѐтся много активных силанольных групп. Часть в) показывает процесс дозакрытия. Маленькие нейтральные группы прививаются к большинству из оставшихся силанольных групп, чтобы уменьшить активность поверхности силикагеля. Часть г) показывает процесс старения колонок с обращѐнной фазой. В принципе, силикагельная основа, к которой привиты все фазы, нестабильна. Силикагель растворяется при повышенных величинах pH (превращаясь в соли кремниевой кислоты) и подвергается разрушению также и при
15 нейтральных pH вводной среде ( обычно гораздо более медленных ). Из-за медленного, но непрерывного растворения кремниевой подложки свободные силанольные группы снова становятся всѐ более и более доступными. Активность поверхности снова повышается. Это выражается в уменьшении времени удерживания до тех пор, пока колонку, наконец, нужно будет заменить. Поэтому в последнее время как носитель для химически привязанных фаз стал использоваться сополимер поливинилового спирта.
Всѐ же первоначально разделяющая способность колонок на полимерной основе была значительно хуже, чем разделительная способность колонок на основе силикагеля. Но дальнейшее развитие принесло свои плоды. На сферических частицах сополимера поливинилового спирта была достигнута высокая плотность ковалентно привитых углеводородных цепей. Сегодня хроматографическое поведение этих фаз практически сравнимо с обычными ОФ колонками. Гидрофильные частицы не имеют проблем со свободными силанольными группами и микропорами. Ковалентная связь между полимерными частицами и алкильными группами делает возможным использование сильнощелочных буферов до величины pH примерно 13. Напротив, привитые фазы на основе силикагеля становятся нестабильными выше pH 7.
16 Рис. 3. Типы модификации силикагеля. а б в г
17 Хроматографические параметры Рис. 4. Иллюстративный материал для характеристики хроматографических параметров.
t
M
- время удерживания несорбируемого соединения t
R1 и t
R2
- абсолютные времена удерживания компонентов 1 и 2. Нулевая (базовая) линия хроматограммы - линия, соответствующая нулевой концентрации анализируемых веществ в элюате. Шум - помехи, статистические флуктуации нулевой линии хроматограммы. Уровень шума складывается из статистических флуктуаций всех параметров, принимающих участие в образовании сигнала детектора. Дрейф нулевой линии - постепенное смещение, регистрируемое на хроматограмме. Хроматографический пик - участок хроматотраммы, соответствующий площади, ограниченной функцией
18 хроматограммы в момент выхода определяемого вещества из колонки и базовой линией. Основание пика - продолжение нулевой линии, соединяющее начало и конец хроматографического пика. Площадь пика, S - площадь хроматограммы, заключенная между пиком и его основанием. В первом приближении S = Высота пика, h - расстояние от максимума пика до его основания, измеренное вдоль оси отклика детектора. Ширина пика у основания, W - отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведѐнными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пикана полувысоте, W
1 2 3 4 5
1/2
- отсекаемый пиком отрезок линии, проведѐнной параллельно основанию пикана середине его высоты. Геометрический объѐм колонки, V
c
- внутреннее пространство пустой колонки. Свободный объѐм, V
o
- часть объѐма колонки, незанятая сорбентом.
Объѐм удерживания вещества, V
R
- объѐм подвижной фазы, затрачиваемой на элюирование пробы вещества. Объѐм удерживания определяют между точкой ввода пробы и точкой, при которой регистрируется максимум сигнала детектора.
Мѐртвый объѐм, V
M
- объѐм подвижной фазы между точкой ввода пробы и точкой еѐ обнаружения (кюветой детектора. Мѐртвый объѐм включает в себя свободный объѐм Приведенный объѐм удерживания, V
R
’ - объѐм удерживания вещества за вычетом мѐртвого объѐма:
19
V
R
' = V
R
- Абсолютное время удерживания вещества, t
R
- время пребывания исследуемого вещества в хроматографе. Практически время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума соответствующего хроматографического пика.
Мѐртвое время, t
M
- время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. На практике мѐртвое время определяют от момента ввода пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора.
Приведѐнное время удерживания, t
R
’ - абсолютное время удерживания за вычетом мѐртвого времени t
R
'= t
R
- Эффективность хроматографической системы
- количество ступеней установления равновесия между подвижной и неподвижной фазой в выбранных условиях для данного сорбата, способность к образованию узкой концентрационной зоны индивидуального компонента разделяемой смеси. Эффективность в численном выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой, эквивалентной теоретической тарелке. Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле
N = 16(t
R
/W
1/2
)
2
= 5,545(t
R
/W)
2
, где t
R
- время удерживания пика, W
1/2
- ширина пикана его полувысоте, W - ширина пика у основания.
20 Высота, эквивалентная теоретической тарелке, H - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая как отношение длины колонки L к числу теоретических тарелок
H = L/N
Приведѐнное число теоретических тарелок N’ - отношение числа реально полученных теоретических тарелок на колонке данной длины к условной колонке длиной 1 м.
N=100N/L, где L - длина колонки в см.
Приведѐнная высота, эквивалентная теоретической тарелке
H’=H/d, где d - средний (эффективный) диаметр частиц сорбента мкм, она также является характеристикой эффективности колонки. Вполне удовлетворительным принято считать колонки со значением H равным 3-3,5d. Очень хорошими считаются колонки с Нравным. Фактор удерживания (коэффициент ѐмкости), k' - один из основополагающих параметров удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая удерживание вещества и равная отношению абсолютного объѐма удерживания к свободному объѐму колонки k’ = V
N
/V
O
, a также отношению приведѐнного времени удерживания км ртвому времени Селективность (относительное удерживание, α
R/cm
, фактор разделения, α) хроматографической системы - избирательность, способность к специфическим
21 взаимодействиям подвижной и неподвижной фазы с молекулами сорбата, обладающими определѐнными структурными признаками, приводящая к разной скорости перемещения концентрационных зон индивидуальных компонентов. Количественно селективность выражается как безразмерная величина, равная отношению приведенного объѐма (времени) удерживания определѐнного вещества, взятого для сравнения стандарта) и хроматографируемого в идентичных условиях
α
R/cm
= k
R
/k cm
= t
R
'/t cm
' = V
R
'/V
cm
' величина, которая пропорциональна отношению приведѐнных времѐн удерживания двух пиков
α (t
R2
- t
M
) / (t
R1
- t
M
) безразмерная величина, характеризующая разделительную способность колонки по отношению к веществам Аи Б и численно равная отношению факторов удерживания или приведѐнных времен
(объѐмов) удерживания БАБ t
А
’/t
Б
’ = V
А
’/V
Б
’. Селективность колонки зависит от многих факторов, варьируя которые можно подобрать оптимальные условия хроматографии интересующей экспериментатора смеси компонентов. Исходя из химической природы разделяемых компонентов, хроматографист должен выбрать подходящий состав растворителя (подвижную фазу) и соответствующий по химической природе сорбент. Определѐнное влияние на селективность имеют и такие термодинамические факторы, как температура и давление в колонке, изменяющие коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами. Коэффициент асимметрии А - отношение двух отрезков, образуемых на горизонтальной линии, проведенной
22 на высоте 10 % от основания пика, при еѐ пересечении с вертикалью, опущенной из вершины пика. При этом берѐтся отношение "тыльного" отрезка к "фронтальному" А = А/В Разрешение пиков,
R
S
- расстояние между максимумами выбранных соседних пиков, делѐнное на полусумму их ширину основания (выраженных в одних и тех же единицах измерения)
R
S
= 2(t
R2
- t
R1
) / (W
b1
+W
b2
) Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.
Экстраколоночное расширение пика (ЭКР) - размывание хроматографической зоны, происходящее в инжекторе, соединительных капиллярах, в ячейке детектора. Эффективность колонки - характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической тарелки. Эффективность колонки тем выше, чем уже ширина пика притом же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N, тем меньше расширение первоначально узкой концентрационной зоны по мере прохождения еѐ через колонку, а значит, же пик на выходе из колонки. Цель работы определить содержание эмоксипина в глазных каплях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
23 Реактивы, оборудование и их характеристика
Гидрофосфат натрия чда ГОСТ 4172-76 Дигидрофосфат калия чда ГОСТ 4198-75 Гидроксид натрия чда ГОСТ 4328-77 Мерная колба ГОСТ 1770-90 Мерный цилиндр ГОСТ 20292-74 Пипетки ГОСТ 20292-74 или дозатор Установка для фильтрования MILLIPOR Хроматограф ВЭЖХ Стайер производства ОАО Аквилон или аналогичный. Методика измерения Согласно действующим фармакопейным статьям предприятия (ФСП), количественное содержание эмоксипина определяют методом прямой спектрофотометрии в УФ-диапозоне, содержание натрия бензоата определяют методом ВЭЖХ. Рис. 5. Схема современного жидкостного хроматографа
24 Целью данной работой является количественное определение эмоксипина и натрия бензоата в глазных каплях.
Разеление проводят на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 (5 мкм) размером х мм при температуре Си скорости потока 1,0 мл/мин в изократическом режиме элюирования. В качестве подвижной фазы используют смесь фосфатного буферного раствора (pH 7,8±0,1) и ацетонитрила в соотношении
8:2, детектируют при длине волны спектрофотометрического детектора 235 нм. Приготовление буферных растворов Раствор гидрофосфата натрия М раствор готовят растворением г Na
2
HPO4 в 500 мл воды) объѐмом мл помещают в колбу на 500 мл и доводят раствором дигидрофосфата калия (0,0667 М раствор готовят растворением 0,915 г KH
2
PO4 в 100 мл воды) до метки. Контрольные вопросы по теме : В чем сущность хроматографического процесса Каково назначение подвижной и неподвижной фаз Какие процессы происходят в колонке Как классифицируют методы хроматографии по агрегатному состоянию фаз и по способу хроматографирования? Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в жидкостной хроматографии Какова роль основных узлов в жидкостном хроматографе высокого давления Что общего и каковы принципиальные отличия от хроматографов ГЖХ или ГХ? Назовите три способы детектирования в жидкостной хроматографии. Чем отличаются нормально- и обращѐнно-фазовый варианты ВЭЖХ?
25 Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ Х
ГФ Х Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии / О.Б.Рудаков, И.А.Востров, С.В.Фѐдоров,
А.А.Филипов, В.Ф.Селеменев, А.А.Приданцев. – Воронеж изд. Водолей, 2004. – 528 с.
Хенке X. Жидкостная хроматография- М изд. Техносфера, 2009. – 264 с. Работа 2. Разделение анионов методом капиллярного электрофореза. Теоретические основы метода Метод капиллярного электрофореза для определения концентрации неорганических анионов основан на их миграции и разделении под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности
Для определения анионов в приборе необходимо установить источник высокого напряжения отрицательной полярности. Тогда электрод на входном конце капилляра будет катодом, а электрод выходного конца – анодом, и анионы будут мигрировать в сторону выходного конца, тек детектору. Фоновый (ведущий) электролит в случае анализа анионов должен удовлетворять нескольким обязательным условиям
– он должен быть щелочным, так как большинство определяемых анионов являются анионами слабых кислот и как таковые существуют только в щелочных средах
– основой электролита должен быть анион, хорошо поглощающий в области рабочих длин волн детектора, так как большинство анионов не обладают собственным
26 поглощением, и их определение может быть проведено лишь косвенным методом
– должно присутствовать вещество, с помощью которого можно обратить направление электроосмотического потока (ЭОП), т.к. в противоположенном случае ЭОП, направленный к катоду, резко замедлит электромиграцию анионов к детектору
– катионный компонент буферного раствора должен быть катионом достаточно сильного основания, ив тоже время обладать малой подвижностью, чтобы обеспечить малую электропроводность раствора. На практике рабочий буферный раствор состоит из смеси диэтаноламина (основание) и хромовой кислоты с добавкой катионного поверхностно-активного вещества бромида цетилтриметиламмония
(ЦТАБ). Избыток диэтаноламина создает слабощелочную среду (рН 9), анион CrO
4 2- обеспечивает необходимое светопоглощение, а катион ЦТАБ, сорбируясь на поверхности кварцевого капилляра, перезаряжает поверхность на положительную, чем достигается изменение направления ЭОП. Порядок выхода анионов следующий хлорид, нитрит, сульфат, нитрат, фторид, гидрофосфат. После выхода гидрофосфата через некоторое время регистрируется пик гидрокарбоната, который присутствует во всех растворах и может служить признаком и сигналом окончания анализа. На электрофореграммах как градуировочных, таки анализируемых растворов часто наблюдаются отрицательные пики. Их появление связано стем, что в анализируемых растворах отсутствуют анионы, которые находятся в растворе фонового электролита. Первый такой пик, связанный с наличием в фоновом электролите бромид-иона, наблюдается между сигналами хлорида и нитрата.
27 Идентификацию и определение анализируемых анионов проводят косвенным методом, регистрируя ультрафиолетовое поглощение на длине волны 254 нм, используя в качестве фонового хроматный электролит. Цель работы освоить капиллярный электрофорез и определить содержание анионов в рабочем растворе. Реактивы, оборудование и их характеристика Электрофоретическая установка со спектрофотометрическим детектором. Капилляр кварцевый длиной ми внутренним диаметром 75 мкм.
0,5 М раствор NaOH.
1 М раствор HCl.
0,025 М раствор оксида хрома.
0,05 М раствор диэтаноламина. Раствор бромида цетилтриметиламмония(БЦТМА)(3 мг/мл). Водный раствор аммиака (1:1). Водный раствор уксусной кислоты (1:9).
0,01 М раствор Трилона Б.
Хроматный рабочий буферный раствор, содержащий 5 ммол/л хрома, 20 ммоль/л диэталамина и 1,65 ммоль/л
БЦТМА. Стандартные растворы хлорида, нитрата, сульфата, нитрата, фосфата и фторида (100 мг/мл). Методика измерения Подготовка нового капилляра к работе выполняется предварительно капилляр промывают в следующей последовательности раствором соляной кислоты в течение
30 мин, затем дистиллированной водой в течение 30 мин, далее раствором гидроксида натрия в течение 30 мини затем
28 60 мин дистиллированной водой. Наконец капилляр промывают 30 мин хроматным буферным раствором. Проверяют готовность к работе на примере анализа раствора, содержащего хлорид-ион (10 мг/л). Система подготовлена к работе, если пик хлорида имеет симметричный контур. Ежедневная подготовка капилляра к работе Перед началом измерений и между ними капилляр промывают следующим образом 2 мин дистиллированной водой, 1 мин раствором соляной кислоты, 2 мин дистиллированной водой и 3 мин хроматным рабочим буферным раствором. По окончании работы капилляр промывают следующим образом 5 мин дистиллированной водой, 5 мин раствором соляной кислоты, 5 мин дистиллированной водой, после чего выключают прибор. Выполнение определения. Готовят 5 градуировочных растворов, содержащих смесь определяемых ионов, содержание анионов в растворе приведено в табл. Приготовленные растворы помещают в виалы и последовательно анализируют, записывая электрофореграммы. Для регистрации электрофореграмм используют соответствующую программу. Данное программное обеспечение, позволяет определить времена миграции анионов, площади их пиков и основные параметры (селективность разделения и разрешение пиков. По полученным значением площади пиков строят градуировочные зависимости площадь пика – концентрация, уравнения, которых заносят в табл. Метод градуировки для каждого программного обеспечения свой, для ПО карат 32 описан ниже. Затем получают электрофореграмму образца анализируемой воды. Проводят идентификацию пиков на электрофореграмме образца анализируемой воды по временам их миграции. Вычисляют концентрацию компонентов в образце воды по ранее
29 полученным градуировочным зависимостям, принимая относительную погрешность определения равной 2,0%. Результаты вносят в табл. Таблица 1. Состав смесей для градуировки системы капиллярного электрофореза Анион Концентрация, мг/мл
№ 1
2 3
4 5 Хлорид
0.5 1.0 5.0 20 50 Сульфат
20 50 1,0 0,5 5,0 Фторид
5.0 0.25 10 1.0 20 Нитрат
5.0 20 0.5 50 1.0 Фосфат
50 20 5.0 1.0 0.5 Таблица 2. Времена миграции анионов и уравнения градуировочных зависимостей для них
№ Анион Время миграции, мин Уравнение градуировочной прямой
1. Хлорид
2. Нитрат
3. Сульфат
4. Фторид
5.
Гидрофосфат Таблица 3. Результаты анализа образца Компонент Время миграции, мин Площадь пика, mAU*c Концентрация, мг/л
30 Рис. Пример разделения Градуировка в карат В этом разделе описывается процедура построения градуировочной зависимости после получения хроматограмм, путѐм последовательного добавления градуировочных точек.
1 Разметка хроматограммы – предназначена для получения замкнутой фигуры из Пика и Базы соединяющей начало и конец пика.
1.1. При настроенном методе разметка работает автоматически.
1.1.1. Для настройки разметки откройте хроматограмму
Offline, для этого щѐлкните Левой кнопкой мыши на ВАШЕМ инструменте и нажимаете строку Open offline в выдающем меню
31 1.1.2. Далее в открывшемся меню находим необходимый файл хроматограммы, для этого щѐлкаем правой кнопкой мыши подалее далее – Open. В появившемся меню выбираем необходимый файл имя файла если необходимо перемещаемся по дереву папок.
32 1.1.3. Если Вас не устраивает текущая градуировка, то очистите «Integration Events» (События интегрирования, для этого Method – далее – Integration Events Выделите строки правой кнопкой мыши вместе, где красная стрелка и удалите с
33 помощью кноп DEL все строки. Закройте таблицу маленьким крестиком.
1.1.4. Нажмите на иконку Threshold показанную внизу Выберите начало, а затем конец области на хроматограмме которая будет использоваться для расчѐта шума (например, от 2 до 6 минут.
34 1.1.5. Нажмите на иконку Width (это первая иконка перед показанной стрелкой, Выберете начало пика, а затем конец, далее добавьте в таблицу, как в пункте 1.1.4.
1.1.6. Для просмотра новой разметки нажмите Analysis
– далее – Analyze. Разметка закончена.
1.2. Для сохранения разметки в Методе нажмите File – далее – Method – далее – Save.
1.3. Таблица компонентов – предназначена для распознавания пиков.
1.3.1. Нажмите иконку Define Peaks, показанную далее Выбираете начало области пиков далее конец области
35 пиков, после чего появится следующее окно, нажмите OK
1.3.2. Нажмите Method – далее – Peaks / groups, появится таблица как показано ниже.
36 Внесите название Ваших пиков в Ряд «Name».
1.3.2.1. Далее передвигая ползунок, выберете тип градуировочного (по точкам или линейное, квадратное уравнение) уравнения в ряду «Fit Type».
1.3.2.2. Заполните ряди т.д. концентрациями каждого компонента (даже для тех хроматограмм, которые Вы ещѐ не открывали.
1.3.3. Откройте Analysis – далее – Analyse/ Single level calibration. В окне отметьте галочкой Calibrate. Укажите номер градуировочного уровня. Нажмите старт.
37 1.3.4. Для просмотра градуировки нажмите Method – далее – Review Calibration.
38 1.3.5. для сохранения градуировки в Методе нажмите
File – далее – Method – далее – Save.
1.4. Для добавления следующей градуировочной точки откройте новый файл как в пи добавьте СЛЕДУЮЩУЮ градуировочную точку как описано в п.
1.3.3. – п. Изменение коснѐтся только указания калибровочного уровняв п. 1.3.3. те. 2 ой.
39 1.5. Повторяйте п столько раз сколько градуировочных точек у Вас.
1.6. Для получения отчѐта откройте хроматограмму образца с неизвестной концентрацией, нажмите Analysis – далее – Analyse, после этого Reports – далее – View или Print
– далее – External Standart. Вы получили отчѐт с концентрацией. Контрольные вопросы по теме : В чѐм отличие хроматографического процесса от капиллярного электрофореза ? Возможно ли в рамках метода капиллярного электрофореза определять органические соединения и какими свойствами они должны обладать Как осуществляется определение ионов спектрофотометрическим детектором, который не может непосредственно их регистрировать Какие виды хроматографии используются для определения ионов Каким образом сказывается применение капилляров разных диаметров, длин и покрытий на результате разделения Возможно ли использование других способов детектирования при определении ионов ? Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ Х
ГФ Х
Бѐккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика методы хроматографии и капиллярного электрофореза. –.- М изд. Техносфера, 2009. – 472 с.
Хенке X. Жидкостная хроматография- М изд. Техносфера, 2009. – 264 с.
40 Работа 3. Определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле Теоретические основы метода Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метиленбисакриламид (сокращенно
– бисакриламид). Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH
4
-SO
4
-SO
4
-NH
4
) или калия, образующий вводном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы (NH
4
-SO
4
). За счет разложения перекиси продуцируются гидроксильные радикалы НО, инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют
N,N,N',N'
– тетраметилэтилендиамин (С N
CH
2
CH
2
N
(CH
3
)
2
(ТЕМЭД). Возможно использование пары катализаторов и инициаторов Персульфат аммония + TEMЭД. Поскольку
41 персульфат аммония нестоек вводном растворе, его часто заменяют персульфатом калия. Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения элекрофореза. Входе полимеризации геля происходит винильная полимеризация, приводящая к формированию полимера с хаотически свернутой структурой, который содержит разветвленную сеть пор. Структура такого рода позволяет просеивать макромолекулы с различным размером. Для характеристики полиакриламидного геля необходимо указывать процентное содержание мономеров. Стандартно используют следующие обозначения Т – процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему раствора, С
– процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров СТ количество акриламида b – количество мономера, образующего сшивки
(бисакриламида); m – объем буфера, мл. Т обычно варьируется в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений Си Т определяется диапазоном
42 фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина Сне должна превышать 1-2%. Чем выше концентрация заполимеризованного акриламида, тем меньше размер пор в геле p = 1,5 d /
c где р – размер пор в ангстремах c – объемная концентрация акриламида d – диаметр молекулы акриламида Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им, тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания сшивки (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением Свыше тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодными вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей
43 образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки Св геле должно быть в пределе 2-
5%. Соотношение между акриламидом и сшивающим агентом определяют механические и физические свойства геля. Для гелей с концентрацией Т 5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %. Для выбора Сбыла предложена следующая эмпирическая формулы СТ)
Бисакриламид, мг = 1300 / акриламид, г Электрофоретическая подвижность – это скорость движения частицы (обычно выражаемая в см) при напряженности электрического поля в 1 В/см. Эта величина имеет размерность см
с В, а еѐ знак совпадает со знаком суммарного заряда макромолекулы. Электрофоретическая подвижность каждого белка зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации и от жесткости упаковки полипептидной цепи. Подвижность макромолекул в
1 2 3 4 5
- отсекаемый пиком отрезок линии, проведѐнной параллельно основанию пикана середине его высоты. Геометрический объѐм колонки, V
c
- внутреннее пространство пустой колонки. Свободный объѐм, V
o
- часть объѐма колонки, незанятая сорбентом.
Объѐм удерживания вещества, V
R
- объѐм подвижной фазы, затрачиваемой на элюирование пробы вещества. Объѐм удерживания определяют между точкой ввода пробы и точкой, при которой регистрируется максимум сигнала детектора.
Мѐртвый объѐм, V
M
- объѐм подвижной фазы между точкой ввода пробы и точкой еѐ обнаружения (кюветой детектора. Мѐртвый объѐм включает в себя свободный объѐм Приведенный объѐм удерживания, V
R
’ - объѐм удерживания вещества за вычетом мѐртвого объѐма:
19
V
R
' = V
R
- Абсолютное время удерживания вещества, t
R
- время пребывания исследуемого вещества в хроматографе. Практически время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума соответствующего хроматографического пика.
Мѐртвое время, t
M
- время пребывания несорбируемого вещества в хроматографе. На практике мѐртвое время определяют от момента ввода пробы несорбируемого вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора.
Приведѐнное время удерживания, t
R
’ - абсолютное время удерживания за вычетом мѐртвого времени t
R
'= t
R
- Эффективность хроматографической системы
- количество ступеней установления равновесия между подвижной и неподвижной фазой в выбранных условиях для данного сорбата, способность к образованию узкой концентрационной зоны индивидуального компонента разделяемой смеси. Эффективность в численном выражении определяется значениями числа теоретических тарелок и высотой, эквивалентной теоретической тарелке. Число теоретических тарелок, N - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая по параметрам удерживания выбранного вещества по формуле
N = 16(t
R
/W
1/2
)
2
= 5,545(t
R
/W)
2
, где t
R
- время удерживания пика, W
1/2
- ширина пикана его полувысоте, W - ширина пика у основания.
20 Высота, эквивалентная теоретической тарелке, H - величина, характеризующая качество колонки и рассчитываемая как отношение длины колонки L к числу теоретических тарелок
H = L/N
Приведѐнное число теоретических тарелок N’ - отношение числа реально полученных теоретических тарелок на колонке данной длины к условной колонке длиной 1 м.
N=100N/L, где L - длина колонки в см.
Приведѐнная высота, эквивалентная теоретической тарелке
H’=H/d, где d - средний (эффективный) диаметр частиц сорбента мкм, она также является характеристикой эффективности колонки. Вполне удовлетворительным принято считать колонки со значением H равным 3-3,5d. Очень хорошими считаются колонки с Нравным. Фактор удерживания (коэффициент ѐмкости), k' - один из основополагающих параметров удерживания в жидкостной хроматографии, безразмерная величина, характеризующая удерживание вещества и равная отношению абсолютного объѐма удерживания к свободному объѐму колонки k’ = V
N
/V
O
, a также отношению приведѐнного времени удерживания км ртвому времени Селективность (относительное удерживание, α
R/cm
, фактор разделения, α) хроматографической системы - избирательность, способность к специфическим
21 взаимодействиям подвижной и неподвижной фазы с молекулами сорбата, обладающими определѐнными структурными признаками, приводящая к разной скорости перемещения концентрационных зон индивидуальных компонентов. Количественно селективность выражается как безразмерная величина, равная отношению приведенного объѐма (времени) удерживания определѐнного вещества, взятого для сравнения стандарта) и хроматографируемого в идентичных условиях
α
R/cm
= k
R
/k cm
= t
R
'/t cm
' = V
R
'/V
cm
' величина, которая пропорциональна отношению приведѐнных времѐн удерживания двух пиков
α (t
R2
- t
M
) / (t
R1
- t
M
) безразмерная величина, характеризующая разделительную способность колонки по отношению к веществам Аи Б и численно равная отношению факторов удерживания или приведѐнных времен
(объѐмов) удерживания БАБ t
А
’/t
Б
’ = V
А
’/V
Б
’. Селективность колонки зависит от многих факторов, варьируя которые можно подобрать оптимальные условия хроматографии интересующей экспериментатора смеси компонентов. Исходя из химической природы разделяемых компонентов, хроматографист должен выбрать подходящий состав растворителя (подвижную фазу) и соответствующий по химической природе сорбент. Определѐнное влияние на селективность имеют и такие термодинамические факторы, как температура и давление в колонке, изменяющие коэффициенты распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами. Коэффициент асимметрии А - отношение двух отрезков, образуемых на горизонтальной линии, проведенной
22 на высоте 10 % от основания пика, при еѐ пересечении с вертикалью, опущенной из вершины пика. При этом берѐтся отношение "тыльного" отрезка к "фронтальному" А = А/В Разрешение пиков,
R
S
- расстояние между максимумами выбранных соседних пиков, делѐнное на полусумму их ширину основания (выраженных в одних и тех же единицах измерения)
R
S
= 2(t
R2
- t
R1
) / (W
b1
+W
b2
) Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по мере возрастания селективности, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.
Экстраколоночное расширение пика (ЭКР) - размывание хроматографической зоны, происходящее в инжекторе, соединительных капиллярах, в ячейке детектора. Эффективность колонки - характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической тарелки. Эффективность колонки тем выше, чем уже ширина пика притом же времени удерживания. Эффективность колонки измеряется числом теоретических тарелок N. Чем выше эффективность, тем больше величина N, тем меньше расширение первоначально узкой концентрационной зоны по мере прохождения еѐ через колонку, а значит, же пик на выходе из колонки. Цель работы определить содержание эмоксипина в глазных каплях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
23 Реактивы, оборудование и их характеристика
Гидрофосфат натрия чда ГОСТ 4172-76 Дигидрофосфат калия чда ГОСТ 4198-75 Гидроксид натрия чда ГОСТ 4328-77 Мерная колба ГОСТ 1770-90 Мерный цилиндр ГОСТ 20292-74 Пипетки ГОСТ 20292-74 или дозатор Установка для фильтрования MILLIPOR Хроматограф ВЭЖХ Стайер производства ОАО Аквилон или аналогичный. Методика измерения Согласно действующим фармакопейным статьям предприятия (ФСП), количественное содержание эмоксипина определяют методом прямой спектрофотометрии в УФ-диапозоне, содержание натрия бензоата определяют методом ВЭЖХ. Рис. 5. Схема современного жидкостного хроматографа
24 Целью данной работой является количественное определение эмоксипина и натрия бензоата в глазных каплях.
Разеление проводят на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 (5 мкм) размером х мм при температуре Си скорости потока 1,0 мл/мин в изократическом режиме элюирования. В качестве подвижной фазы используют смесь фосфатного буферного раствора (pH 7,8±0,1) и ацетонитрила в соотношении
8:2, детектируют при длине волны спектрофотометрического детектора 235 нм. Приготовление буферных растворов Раствор гидрофосфата натрия М раствор готовят растворением г Na
2
HPO4 в 500 мл воды) объѐмом мл помещают в колбу на 500 мл и доводят раствором дигидрофосфата калия (0,0667 М раствор готовят растворением 0,915 г KH
2
PO4 в 100 мл воды) до метки. Контрольные вопросы по теме : В чем сущность хроматографического процесса Каково назначение подвижной и неподвижной фаз Какие процессы происходят в колонке Как классифицируют методы хроматографии по агрегатному состоянию фаз и по способу хроматографирования? Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в жидкостной хроматографии Какова роль основных узлов в жидкостном хроматографе высокого давления Что общего и каковы принципиальные отличия от хроматографов ГЖХ или ГХ? Назовите три способы детектирования в жидкостной хроматографии. Чем отличаются нормально- и обращѐнно-фазовый варианты ВЭЖХ?
25 Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ Х
ГФ Х Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии / О.Б.Рудаков, И.А.Востров, С.В.Фѐдоров,
А.А.Филипов, В.Ф.Селеменев, А.А.Приданцев. – Воронеж изд. Водолей, 2004. – 528 с.
Хенке X. Жидкостная хроматография- М изд. Техносфера, 2009. – 264 с. Работа 2. Разделение анионов методом капиллярного электрофореза. Теоретические основы метода Метод капиллярного электрофореза для определения концентрации неорганических анионов основан на их миграции и разделении под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности
Для определения анионов в приборе необходимо установить источник высокого напряжения отрицательной полярности. Тогда электрод на входном конце капилляра будет катодом, а электрод выходного конца – анодом, и анионы будут мигрировать в сторону выходного конца, тек детектору. Фоновый (ведущий) электролит в случае анализа анионов должен удовлетворять нескольким обязательным условиям
– он должен быть щелочным, так как большинство определяемых анионов являются анионами слабых кислот и как таковые существуют только в щелочных средах
– основой электролита должен быть анион, хорошо поглощающий в области рабочих длин волн детектора, так как большинство анионов не обладают собственным
26 поглощением, и их определение может быть проведено лишь косвенным методом
– должно присутствовать вещество, с помощью которого можно обратить направление электроосмотического потока (ЭОП), т.к. в противоположенном случае ЭОП, направленный к катоду, резко замедлит электромиграцию анионов к детектору
– катионный компонент буферного раствора должен быть катионом достаточно сильного основания, ив тоже время обладать малой подвижностью, чтобы обеспечить малую электропроводность раствора. На практике рабочий буферный раствор состоит из смеси диэтаноламина (основание) и хромовой кислоты с добавкой катионного поверхностно-активного вещества бромида цетилтриметиламмония
(ЦТАБ). Избыток диэтаноламина создает слабощелочную среду (рН 9), анион CrO
4 2- обеспечивает необходимое светопоглощение, а катион ЦТАБ, сорбируясь на поверхности кварцевого капилляра, перезаряжает поверхность на положительную, чем достигается изменение направления ЭОП. Порядок выхода анионов следующий хлорид, нитрит, сульфат, нитрат, фторид, гидрофосфат. После выхода гидрофосфата через некоторое время регистрируется пик гидрокарбоната, который присутствует во всех растворах и может служить признаком и сигналом окончания анализа. На электрофореграммах как градуировочных, таки анализируемых растворов часто наблюдаются отрицательные пики. Их появление связано стем, что в анализируемых растворах отсутствуют анионы, которые находятся в растворе фонового электролита. Первый такой пик, связанный с наличием в фоновом электролите бромид-иона, наблюдается между сигналами хлорида и нитрата.
27 Идентификацию и определение анализируемых анионов проводят косвенным методом, регистрируя ультрафиолетовое поглощение на длине волны 254 нм, используя в качестве фонового хроматный электролит. Цель работы освоить капиллярный электрофорез и определить содержание анионов в рабочем растворе. Реактивы, оборудование и их характеристика Электрофоретическая установка со спектрофотометрическим детектором. Капилляр кварцевый длиной ми внутренним диаметром 75 мкм.
0,5 М раствор NaOH.
1 М раствор HCl.
0,025 М раствор оксида хрома.
0,05 М раствор диэтаноламина. Раствор бромида цетилтриметиламмония(БЦТМА)(3 мг/мл). Водный раствор аммиака (1:1). Водный раствор уксусной кислоты (1:9).
0,01 М раствор Трилона Б.
Хроматный рабочий буферный раствор, содержащий 5 ммол/л хрома, 20 ммоль/л диэталамина и 1,65 ммоль/л
БЦТМА. Стандартные растворы хлорида, нитрата, сульфата, нитрата, фосфата и фторида (100 мг/мл). Методика измерения Подготовка нового капилляра к работе выполняется предварительно капилляр промывают в следующей последовательности раствором соляной кислоты в течение
30 мин, затем дистиллированной водой в течение 30 мин, далее раствором гидроксида натрия в течение 30 мини затем
28 60 мин дистиллированной водой. Наконец капилляр промывают 30 мин хроматным буферным раствором. Проверяют готовность к работе на примере анализа раствора, содержащего хлорид-ион (10 мг/л). Система подготовлена к работе, если пик хлорида имеет симметричный контур. Ежедневная подготовка капилляра к работе Перед началом измерений и между ними капилляр промывают следующим образом 2 мин дистиллированной водой, 1 мин раствором соляной кислоты, 2 мин дистиллированной водой и 3 мин хроматным рабочим буферным раствором. По окончании работы капилляр промывают следующим образом 5 мин дистиллированной водой, 5 мин раствором соляной кислоты, 5 мин дистиллированной водой, после чего выключают прибор. Выполнение определения. Готовят 5 градуировочных растворов, содержащих смесь определяемых ионов, содержание анионов в растворе приведено в табл. Приготовленные растворы помещают в виалы и последовательно анализируют, записывая электрофореграммы. Для регистрации электрофореграмм используют соответствующую программу. Данное программное обеспечение, позволяет определить времена миграции анионов, площади их пиков и основные параметры (селективность разделения и разрешение пиков. По полученным значением площади пиков строят градуировочные зависимости площадь пика – концентрация, уравнения, которых заносят в табл. Метод градуировки для каждого программного обеспечения свой, для ПО карат 32 описан ниже. Затем получают электрофореграмму образца анализируемой воды. Проводят идентификацию пиков на электрофореграмме образца анализируемой воды по временам их миграции. Вычисляют концентрацию компонентов в образце воды по ранее
29 полученным градуировочным зависимостям, принимая относительную погрешность определения равной 2,0%. Результаты вносят в табл. Таблица 1. Состав смесей для градуировки системы капиллярного электрофореза Анион Концентрация, мг/мл
№ 1
2 3
4 5 Хлорид
0.5 1.0 5.0 20 50 Сульфат
20 50 1,0 0,5 5,0 Фторид
5.0 0.25 10 1.0 20 Нитрат
5.0 20 0.5 50 1.0 Фосфат
50 20 5.0 1.0 0.5 Таблица 2. Времена миграции анионов и уравнения градуировочных зависимостей для них
№ Анион Время миграции, мин Уравнение градуировочной прямой
1. Хлорид
2. Нитрат
3. Сульфат
4. Фторид
5.
Гидрофосфат Таблица 3. Результаты анализа образца Компонент Время миграции, мин Площадь пика, mAU*c Концентрация, мг/л
30 Рис. Пример разделения Градуировка в карат В этом разделе описывается процедура построения градуировочной зависимости после получения хроматограмм, путѐм последовательного добавления градуировочных точек.
1 Разметка хроматограммы – предназначена для получения замкнутой фигуры из Пика и Базы соединяющей начало и конец пика.
1.1. При настроенном методе разметка работает автоматически.
1.1.1. Для настройки разметки откройте хроматограмму
Offline, для этого щѐлкните Левой кнопкой мыши на ВАШЕМ инструменте и нажимаете строку Open offline в выдающем меню
31 1.1.2. Далее в открывшемся меню находим необходимый файл хроматограммы, для этого щѐлкаем правой кнопкой мыши подалее далее – Open. В появившемся меню выбираем необходимый файл имя файла если необходимо перемещаемся по дереву папок.
32 1.1.3. Если Вас не устраивает текущая градуировка, то очистите «Integration Events» (События интегрирования, для этого Method – далее – Integration Events Выделите строки правой кнопкой мыши вместе, где красная стрелка и удалите с
33 помощью кноп DEL все строки. Закройте таблицу маленьким крестиком.
1.1.4. Нажмите на иконку Threshold показанную внизу Выберите начало, а затем конец области на хроматограмме которая будет использоваться для расчѐта шума (например, от 2 до 6 минут.
34 1.1.5. Нажмите на иконку Width (это первая иконка перед показанной стрелкой, Выберете начало пика, а затем конец, далее добавьте в таблицу, как в пункте 1.1.4.
1.1.6. Для просмотра новой разметки нажмите Analysis
– далее – Analyze. Разметка закончена.
1.2. Для сохранения разметки в Методе нажмите File – далее – Method – далее – Save.
1.3. Таблица компонентов – предназначена для распознавания пиков.
1.3.1. Нажмите иконку Define Peaks, показанную далее Выбираете начало области пиков далее конец области
35 пиков, после чего появится следующее окно, нажмите OK
1.3.2. Нажмите Method – далее – Peaks / groups, появится таблица как показано ниже.
36 Внесите название Ваших пиков в Ряд «Name».
1.3.2.1. Далее передвигая ползунок, выберете тип градуировочного (по точкам или линейное, квадратное уравнение) уравнения в ряду «Fit Type».
1.3.2.2. Заполните ряди т.д. концентрациями каждого компонента (даже для тех хроматограмм, которые Вы ещѐ не открывали.
1.3.3. Откройте Analysis – далее – Analyse/ Single level calibration. В окне отметьте галочкой Calibrate. Укажите номер градуировочного уровня. Нажмите старт.
37 1.3.4. Для просмотра градуировки нажмите Method – далее – Review Calibration.
38 1.3.5. для сохранения градуировки в Методе нажмите
File – далее – Method – далее – Save.
1.4. Для добавления следующей градуировочной точки откройте новый файл как в пи добавьте СЛЕДУЮЩУЮ градуировочную точку как описано в п.
1.3.3. – п. Изменение коснѐтся только указания калибровочного уровняв п. 1.3.3. те. 2 ой.
39 1.5. Повторяйте п столько раз сколько градуировочных точек у Вас.
1.6. Для получения отчѐта откройте хроматограмму образца с неизвестной концентрацией, нажмите Analysis – далее – Analyse, после этого Reports – далее – View или Print
– далее – External Standart. Вы получили отчѐт с концентрацией. Контрольные вопросы по теме : В чѐм отличие хроматографического процесса от капиллярного электрофореза ? Возможно ли в рамках метода капиллярного электрофореза определять органические соединения и какими свойствами они должны обладать Как осуществляется определение ионов спектрофотометрическим детектором, который не может непосредственно их регистрировать Какие виды хроматографии используются для определения ионов Каким образом сказывается применение капилляров разных диаметров, длин и покрытий на результате разделения Возможно ли использование других способов детектирования при определении ионов ? Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ Х
ГФ Х
Бѐккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика методы хроматографии и капиллярного электрофореза. –.- М изд. Техносфера, 2009. – 472 с.
Хенке X. Жидкостная хроматография- М изд. Техносфера, 2009. – 264 с.
40 Работа 3. Определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле Теоретические основы метода Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метиленбисакриламид (сокращенно
– бисакриламид). Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH
4
-SO
4
-SO
4
-NH
4
) или калия, образующий вводном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы (NH
4
-SO
4
). За счет разложения перекиси продуцируются гидроксильные радикалы НО, инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют
N,N,N',N'
– тетраметилэтилендиамин (С N
CH
2
CH
2
N
(CH
3
)
2
(ТЕМЭД). Возможно использование пары катализаторов и инициаторов Персульфат аммония + TEMЭД. Поскольку
41 персульфат аммония нестоек вводном растворе, его часто заменяют персульфатом калия. Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения элекрофореза. Входе полимеризации геля происходит винильная полимеризация, приводящая к формированию полимера с хаотически свернутой структурой, который содержит разветвленную сеть пор. Структура такого рода позволяет просеивать макромолекулы с различным размером. Для характеристики полиакриламидного геля необходимо указывать процентное содержание мономеров. Стандартно используют следующие обозначения Т – процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему раствора, С
– процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров СТ количество акриламида b – количество мономера, образующего сшивки
(бисакриламида); m – объем буфера, мл. Т обычно варьируется в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений Си Т определяется диапазоном
42 фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина Сне должна превышать 1-2%. Чем выше концентрация заполимеризованного акриламида, тем меньше размер пор в геле p = 1,5 d /
c где р – размер пор в ангстремах c – объемная концентрация акриламида d – диаметр молекулы акриламида Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им, тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания сшивки (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением Свыше тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодными вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей
43 образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки Св геле должно быть в пределе 2-
5%. Соотношение между акриламидом и сшивающим агентом определяют механические и физические свойства геля. Для гелей с концентрацией Т 5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %. Для выбора Сбыла предложена следующая эмпирическая формулы СТ)
Бисакриламид, мг = 1300 / акриламид, г Электрофоретическая подвижность – это скорость движения частицы (обычно выражаемая в см) при напряженности электрического поля в 1 В/см. Эта величина имеет размерность см
с В, а еѐ знак совпадает со знаком суммарного заряда макромолекулы. Электрофоретическая подвижность каждого белка зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации и от жесткости упаковки полипептидной цепи. Подвижность макромолекул в
1 2 3 4 5
полиакриламидном геле обратно пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона):
Lg U = lg U
0
– K
r
Т
K
r
– коэффициент задержки – подвижность макромолекул в геле
U
0
– подвижность макромолекул в свободном растворе;
Т – плотность геля (концентрация мономеров) Одним из наиболее популярных методов является электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата
44 натрия (ДСН), который позволяет фракционировать белки в зависимости от значения только одного параметра – их молекулярной массы. Основной принцип метода – снижение влияния заряда макромолекулы на ее электрофоретическую подвижность. В этом случае должна наблюдаться пропорциональность между молекулярной массой макромолекулы и ее сопротивлением трения (коэффициентом задержки. Для этого белки обрабатывают избытком ДСН, который примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДСН с 1 мг белка. Избыток остатков сульфокислоты делает несущественным собственный заряд белка, а постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к массе для любого белка. Кроме того, при обработке белка ДСН полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения, размер большой оси вращения которого линейно связан с числом аминокислотных остатков, а, следовательно, с молекулярной массой белка. Цель работы освоить электрофорез в геле полиакриламида и определить молекулярную массу исследуемого белка. Реактивы, оборудование им bbетодика измерения Для получения раствора разделяющего геля смешивают компоненты. Перед добавлением персульфата из раствора удаляют под вакуумом воздух, так как, во-первых, следа молекулярного кислорода подавляют процесс полимеризации, и во-вторых, в результате образования тепла вовремя электрофореза другие газы, присутствующие в геле,
45 выделяются в виде пузырьков и искажают условия проведения опыта. После добавления персульфата раствор геля заливают между пластинками и сверху аккуратно наслаивают водой, которая препятствует образованию мениска, то есть искривлению поверхности геля, и одновременно мешает доступу атмосферного кислорода, тормозящего полимеризацию. Полимеризация обычно начинается через 20 минут и заканчивается через 45 минут. После этого воду убирают, а остатки воды удаляют фильтриком из фильтрованной бумаги. Далее поверхность разделяющего геля ополаскивают небольшим количеством раствора концентрирующего геля, который наливают между пластинок и вставляют гребенку, которая создает лунки для нанесения образцов. Полимеризация начинается примерно через 5 минут. По окончании полимеризации гель помещают в электрофорезную ячейку, в которую добавляют электродный буфер. Далее гребенку удаляют ив полученные лунки наносят исследуемую пробу. Электрофорезную ячейку подключают к источнику тока.
1) Приготовление растворов, буферов и образцов Для всех растворов необходимо использовать либо бидистиллированную либо деионизированную (milliQ) воду. рН трис растворов доводить концентрированной соляной кислотой (не доводить рН NaOH нив коем случае – это приводит к увеличению ионной силы буфера, образующийся
NaCl сильно влияет насилу тока при эф. Стоки, содержащие акриламид и бисакриламид необходимо растворять при постоянном перемешивании (на вортексе), после доведения объема обязательно профильтровать. Хранить при +Сне более х месяцев.
30 % р-р акриламида
- акриламид – 14,5 г
46
- N, N – метиленбисакриламид – 0,45 г
- вода очищенная – до 50 мл Профильтровать (0,22 – 0,45 мкм) Хранить при температуре 2-8 С, срок годности - 6 месяцев М раствор трис-HCl, рН 8,8:
- трис(оксиметил)аминометан – 6,05 г
- кислота соляная до рН 8,8
- вода очищенная – до 50 мл Профильтровать (0,22 – 0,45 мкм) Хранить при температуре 2-8 С, срок годности - 6 месяцев М раствор трис-HCl, рН 6,8:
- трис(оксиметил)аминометан – 6,05 г
- кислота соляная до рН 6,8
- вода очищенная – до 50 мл Профильтровать (0,22 – 0,45 мкм) Хранить при температуре 2-8 С, срок годности - 6 месяцев
10 % натрия додецилсульфата (ДСН):
- натрия додецилсульфата – 5 г
- вода очищенная – до 50 мл Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 1 год.
10 % раствор аммония персульфата
- аммония персульфата – около 50 мг
- вода очищенная - до 100 мг/мл Используется свежеприготовленный.
Изобутанол, насыщенный водой
- изобутанол (бутанол) – 8 мл
- вода очищенная – 2 мл
47 Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 5 лет кратный электродный буферный раствор
- трис(оксиметил)аминометан – 7,55 г
- глицин – 36 г
- вода очищенная – до 250 мл Хранить при температуре 2-8 С, срок годности - 1 год Электродный буферный раствор
- кратный электродный буферный раствор – 20 мл
- 10 % ДСН – 2 мл
- вода очищенная – до 200 мл Используется свежеприготовленный Разделяющий гель
- 30 % АА-бис – 2,75 мл
- 1 М Трис-HCl рН 8,8 – 8,48 мл
- 10 % SDS – 6,6 мкл
- ТЭМЭД –12 мкл
- вода очищенная – 1,27 мкл
- ПСА 10 % - 24 мкл Общий объѐм – 6,6 мл Добавлять последовательно ТЭМЭД и ПСА (перед заливанием в пластинки) тщательно перемешать полученный раствор, важно, чтобы в процессе перемешивания не образовались пузырьки с газом. Концентрирующий гель
-- 30 % АА-бис – 1,66 мл
- 1 М Трис-HCl рН 6,8 - 1,25 мл
- 10 % ДДС- натрия – 100 мкл
- ТЭМЭД – 20 мкл Разделить на две части объем по 4,99 мл. В одну часть добавить 20 мкл ПСА. Буфер для образца с ДТТ и глицерином
48
- М Трис-HCl рН 6,8 – 7,5 мкл
- глицерин 87% - 304 мкл
- 10 % SDS – 300 мкл
- вода очищенная – до 1,5 мл
- бромфенил голубой - до чернильной окраски Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 1 год. Перед использованием добавить 7-8 мкл ДТТ (в 5 мл раствора добавляется 1,2 мг дитиостреит). Образцы – ERO 4,5 мг/мл и Hs-ERO 5 мг/мл Буфер для FMR на 50 мкл
- ERO – 14 мкл
- буфера для образца с ДТТ– 25 мкл
- вода очищенная – 10,8 мкл
LMW
β на 200 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 100 мкл
- вода очищенная – 100 мкл
ERO
β
на 32 мкл
- ERO
– 8 мкл
- буфер для образца с β-маркапто-этанолом – 12 мкл
- вода очищенная – 12 мкл
Hs-ERO
β
на 32 мкл
- Hs-ERO
– 8 мкл
- буфер для образца с β-маркапто-этанолом – 12 мкл
- вода очищенная – 12 мкл Буфер с β-маркапто-этанолом разведенный в 2 раза на 30 мкл
- буфер с β-маркапто-этанолом – 15 мкл
- вода очищенная – 15 мкл
LMW
ddt
На 40 мкл
- LMW – 15 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 25 мкл
49
ERO
ddt на 32 мкл
- ERO – 8 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 24 мкл
Hs-ERO
ddt на 32 мкл
- Hs-ERO – 8 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 24 мкл
ERO
ddt разбавленный враз на 30 мкл
- ERO – 3 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 27 мкл
Hs-ERO
ddt разбавленный враз на 30 мкл
- Hs-ERO – 3 мкл
- буфер для образца с ДТТ – 27 мкл Фиксирующий раствор
- спирт этиловый – 45 мл
- кислота уксусная – 10 мл
- вода очищенная – 45 мл Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 1 год. Раствор для окрашивания
- Кумасси R-250 – 0,2 г
- Кумасси G-250 – 0,2 г
- фиксирующий раствор – 200 мл Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 1 год Раствор для отмывания
- кислота уксусная 20,8 мл
- вода очищенная – 280 мл Хранить при комнатной температуре. Срок годности – 1 год
2) Полимеризация полиакриламидных гелей Собрать систему для заливки гелей необходимо поместить зафиксированные стеклянные пластинки с
50 находящимися между ними спейсерами на заливочный столик так, чтобы гель находился между стеклянными пластинками. Оставить зазор снизу размером меньше 3 см между пластинками, для удобства нанесения геля. Добавить персульфат в раствори залить разделяющий гель. Дождаться пока гель застынет и появится четкая граница между водой и гелем - удалить наслоенную воду. Осторожно наслоить на раствор разделяющего геля тонкий слой изобутанола и оставить гель застывать (до 20 минут. После застывания удалить слой изобутанола с поверхности застывшего разделяющего геля. В раствор для концентрирующего геля добавляем персульфат.
Наслоить на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля и немедленно вставить гребенку. Оставить застывать гель (до
20 минут. Готовим растворы и нагреваем при 95 Св течении 5 минут. Вынимаем гребенку из застывшего концентрирующего геля и промываем кармашки водой.
3) Подготовка электрофорезной камеры Поставить электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность. Удалить пластины с гелем с заливочного столика и закрепить в электрофорезной камере. Заливаем электродный буфер (свежеприготовленный) в верхнюю часть камеры в нижнюю и верхнюю часть электрофорезной камеры так, чтобы уровень буфера на 0,5 см был выше уровня геля.
4) Подготовка и нанесение образцов Готовим образцы для электрофореза смешиваем анализируемые пробы с буфером для образцов в соотношении 1:1 и кипятим 5 мин. Охладить образцы до комнатной температуры, после чего слегка крутануть на цетрифуге (чтобы снять конденсат с крышки и стенок. В