Файл: Практикум по физикохимическим методам в биотехнологии Учебнометодическое пособие Утверждено.pdf

51 полученные карманы геля осторожно наносим пробы по 4 мкл. Вовсе лунки вводили по 5 мкг белка,кроме лунок №9 ив них по 0,5 мкг. Из-за разности в плотности с катодным буфером опускаются на дно кармашков. В нижнюю часть камеры заливаем анодный буфер. Схема расположения образцов в кармане
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10 11 12
FMR LMW
β
ERO
β
Hs-
ERO
β
B
β
LMW
ddt
ERO
ddt
Hs-
ERO
ddt
ERO
10
Hs-
ERO
10
B
ddt
FMR
5) Проведение электрофореза Полностью собираем систему для проведения электрофореза и подключаем ее к источнику тока сначала форез ведется притоке мА, 220 V в течении 15 минут. После перехода лидирующего красителя из концентрирующего в разделяющий гель силу тока увеличивают до 16 мА, 220 В в течении 70 минут. Выключаем систему, после того как полоса лидирующего красителя дойдет до нижней границы геля отключить ток. Удалить пластинки с гелем из электрофорезной камеры. Осторожно вынуть спейсеры, находящиеся между стеклянными пластинками. Отделить гель от стеклянных пластинок.
6) Фиксация и окраска геля Отделенный гель помещают в фисирующий раствор в течение 35 минут при медленном перемешивании на шейкере. Удаляют раствор для фиксации и наливают раствор для окрашивания и выдерживают 15 минут. Отмывают от избыточного фона краски 7 % раствором уксусной кислоты 3 раза поч) Анализ результатов Используя систему гель-документирования, сканируют гель и анализируют полученные результаты.

52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рис. Пример разделения белков методом электрофореза в полиакриламидном геле (после фиксирующего раствора. Контрольные вопросы по теме : Как влияют характеристики полученного геля на подвижность белков ? Имеются ли другие методы определения массы белков ? Можно ли использовать данный метод для разделения других биологическиактивных соединений и какими свойствами должны обладать разделяемые компоненты ? Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ Х
ГФ Х
Уилсон К. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. – М изд. Бином. Лаборатория знаний, 2014. – 848 с.
Улащик В.С. Электрофорез лекарственных веществ. – Минск изд. «Беларуская Наука. – 403 с.

53
3. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Спектроскопические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного определения светопоглощающих соединений. В зависимости от используемой аппаратуры в фармацевтическом анализе различают следующие методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излучения и испускании света
- спектрофотометрия в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях
- спектрофотометрия в инфракрасной (ИК) области
- атомно-эмиссионная и атомно-абсорбционная спектроскопия (АЭС и ААС);
- флуориметрия;
- спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР. Ряд длин волн, для которых проводятся измерения методами абсорбционной спектрофотометрии, охватывает спектральную область от коротких длин волн в УФ-области до
ИК-области. Для удобства отнесений этот спектральный ряд делится наследующие диапазоны длин волн УФ (от 190 до
380 нм, видимый (от 380 до 780 нм, ИК (от 0,78 до 400 мкм.

54 Работа 4. Определение подлинности субстанции
«Эноксопарин натрия и посторонних примесей в субстанции Гепарин натрия методом ЯМР. Теоретические основы метода Вещества, ядра атомов которых имеют магнитные моменты, в постоянном магнитном поле поглощают энергию электромагнитных волн радиочастотный диапазон) при определенном соотношении между величинами постоянного магнитного поля и частотой переменного поля (ядерный магнитный резонанс, ЯМР. Частота ν
0
= ω
0
/2π, при которой выполняется условие резонанса ω
0
= γ × В
(γ – постоянная, носит название гиромагнитное отношение) называется резонансной частотой. Магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетным атомным весом НС. Не имеют магнитных моментов ядра атомов счетным зарядом и четным атомным весом (
12
C,
16
O) . Спектр ЯМР может быть получен двумя способами или при непрерывном облучении образца слабым электромагнитным полем с изменяющейся частотой, в результате чего получается непосредственно спектр ЯМР спектроскопия с непрерывным облучением, или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса с последующим
Фурье-преобразованием отклика, представляющего собой сигнал свободной индукции, в спектр (импульсная спектроскопия. В молекулах положение энергетических уровней,

55 переходы между которыми образуют спектр ЯМР, определяется величиной взаимодействия магнитных моментов ядер с постоянным магнитным полем В
лок и с магнитными моментами других ядер через посредство электронов молекулы (спин-спиновое взаимодествие). Электроны атомов уменьшают величину внешнего магнитного поля В вместе нахождения ядра В
лок
= В
×
(1− σ), σ>0, константа экранирования – безразмерная величина. Разница в резонансных частотах сигналов, равная разнице в константах экранирования ядер, называется химическим сдвигом сигналов (обозначается символом δ, измеряется в миллионных долях, м.д.). Спин- спиновое взаимодействие, характеризуемое константой
спин-спинового взаимодействия обозначается символом J, измеряется в герцах, приводит к образованию мультиплетов. Значения δ и J не зависят от величины постоянного магнитного поля. Количество компонент в мультиплетах определяется спином ядра и количеством взаимодействующих ядер. Диапазон химических сдвигов сигналов ядер водорода не превосходит 20 м.д. Диапазон химических сдвигов сигналов других ядер измеряется сотнями м.д. Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) веществ в растворах определяется временем поперечной релаксации Т, характеризующим время установления равновесия в системе спинов, а также неоднородностью магнитного поля. Определяемая этими величинами ширина сигналов ядер со спином ½ обычно не превосходит 1 Гц. Уширение сигналов происходит в результате обменных процессов или

56 присутствием в молекуле ядер со спином большим ½. Интенсивность сигнала ЯМР в спектре определяется избытком количества ядер на нижнем энергетическом уровне. Отношение количества ядер N
– и N
+ соответственно на верхнем и нижнем энергетических уровнях определяется фактором Больцмана N
-
/N
+
= ехр(-
µ
n
B
0
/IkT), где k – постоянная Больцмана, µ
n
– магнитный момент ядра, Т – абсолютная температура, I – спин ядра (при этом µ
n
B
0
/I << kT). Очень небольшая разница в энергиях между возбужденными основным состоянием ядер является основной причиной сравнительно низкой чувствительности метода ЯМР. Уменьшение интенсивности сигналов также связано со сравнительно большим временем нахождения системы ядер в возбужденном состоянии и большим временем релаксации постоянная, характеризующая время релаксации обозначается символом Т. Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. Частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода, называется рабочей частотой ЯМР спектрометра. Спектроскопия ЯМР на ядрах водорода и углерода С (естественное содержание 1,1 %) наиболее часто используется в исследовании органических лекарственных веществ. Широкополосные импульсные ЯМР-спектрометры позволяют получать спектры практически от всех элементов периодической системы. Прибор. ЯМР-спектрометр для спектроскопии с непрерывным облучением состоит из магнита, генератора

57 изменяющейся частоты, датчика, генератора радиочастоты и приемника, а также электронного интегратора и самопишущего потенциометра. Импульсные спектрометры, кроме того, имеют генератор импульсов и компьютер для преобразования интерферограммы отклика в спектр. Рабочая частота спектрометра не должна быть меньше 60 МГц. Если в частной фармакопейной статье не оговорено, то необходимо соблюдать следующие условия
1) Разрешение должно быть 0,5 Гц или менее.
2) Амплитуда боковых сигналов, появляющихся при вращении образца, не должна превышать 2 % от основного сигнала.
3) При количественных измерениях с использованием интегралов сигналов ни одно из пяти измерений не должно превосходить 2,5 % от среднего значения.
4) Разрешение и отношение сигнал/шум следует измерять, используя соответствующие команды в пакете стандартных программ. Метод. Растворенное вещество должно быть подписано и отфильтровано раствор должен быть прозрачным. Перед регистрацией спектра фаза сигнала должна быть отрегулирована по возможности на поглощение. Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах Ни С измеряется относительно сигнала тетраметилсилана
(ТМС), положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических

58 сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (δ – шкала химических сдвигов. Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР Н используется
2,2-диметил-2- силапентан-5-сульфонат натрия (Д, химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров Сводных растворов в качестве эталона используют диоксан (ДО, химический сдвиг которого равен 67,4 м.д. В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию. Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов растворителей имеют следующие значения хлороформ – 7,26; бензол – 7,16; вода – 4,7; метанол – 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид – 2,50; ацетон – 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от рН среды и температуры. Для того чтобы избежать уширения сигналов при использовании смешанных растворителей, перед получением спектров необходимо выждать время для гомогенизации смеси растворителей, которое может составлять часы. Для спектроскопии с непрерывным облучением амплитуда переменной частоты не должна быть большой, чтобы избежать насыщения сигнала. Наиболее интенсивный сигнал должен занимать почти всю ширину

59 бланка. Кривая интеграла записывается поверх сигналов спектра. В импульсных спектрометрах устанавливают следующие параметры ширина спектра, время регистрации сигнала, длительность радиочастотного импульса, количество точек для Фурье-преобразования спектральное разрешение) и количество накоплений сигнала свободной индукции. Имеется ряд методик получения сигналов ЯМР, которые могут быть использованы при решении аналитических задач. В основе каждой из них используется определенная последовательность импульсов. Методики принято обозначать несколькими заглавными буквами латинского алфавита. Например, используемая часто методика COSY является сокращением словосочетания
correlation
spectroscopy. Обычные одномерные) спектры получают воздействием на вещество одним радиочастотным импульсом, при завершении которого проводится считывание сигнала (свободная индукция) от ядер образца с последующим преобразованием сигнала свободной индукции в спектр
(Фурье-преобразование). Для слабых сигналов цикл возбуждение – считывание с накоплением сигнала повторяется многократно, чем достигается необходимое для анализа отношение сигнал/шум. Для количественных измерений цикл возбуждение – считывание повторяется через интервал времени, превышающим время релаксации Т в несколько раз. Для измерения времени Т следует использовать программу в пакете стандартных программ, прилагаемых к

60
ЯМР-спектрометрам. Наряду с одномерными в аналитических целях используются двумерные корреляционные спектры, получаемые методиками COSY (для ядер одного вида,
HETCOR (для разных ядер) и др. В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов (перенос когерентности, называемых кросс- пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер. Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросспиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах. Для быстрого получения спектров гетероядер Сидр) применяются методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах Н спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия. Методика DOSY позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения. Методика основана на различии в скоростях диффузии различных молекул. Области применения. Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для установления подлинности и количественных определений.
1. Установление подлинности вещества. В спектрах ЯМР практически исключается совпадение даже нескольких сигналов от разных веществ. При заявлении спектра на подлинность желательно ограничиваться по

61 возможности меньшим количеством сигналов. При описании спектров необходимо приводить значения химических сдвигов и мультиплетность сигналов, заявленных на подлинность. Следует указывать рабочую частоту спектрометра, т.к. от нее зависит вид спектра. По этой же причине не использовать формулировку такой же вид, как и на приведенном (в НД) спектре. Для установления подлинности смеси веществ экстрактов) эффективна двумерная ЯМР-спектроскопия. При описании двумерных спектров (фрагментов спектра, заявленных на подлинность, следует приводить значения кросспиков.
2. Определение количества посторонних примесей. При получении спектров ЯМР, как правило, легко достигается значение отношения сигнал/шум более 100, что позволяет использовать этот метод для определения в субстанции примеси в количествах, измеряемых процентами и долями процента.
3. Определение количества остаточных растворителей. Все растворители, содержащие атомы водорода и углерода, дают характерные сигналы в спектрах Ни С ЯМР. Чувствительность метода ЯМР к сигналам растворителя весьма высокая.
4. Количественное определение относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества примеси. Содержание вещества (Х %) определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов анализируемого вещества, не перекрываясь сними. Интенсивности сигналов анализируемого вещества