Файл: Практикум по физикохимическим методам в биотехнологии Учебнометодическое пособие Утверждено.pdf

66 Контрольные вопросы по теме Преимущества и ограничения определения веществ с помощью метода ЯМР спектроскопии. Особенности применения спектроскопии ЯМР Ни ЯМР С. Счем связана разница в навесках образцов для двух анализов Какова роль дейтерометанола при определении подлинности эноксапарина? Почему, кроме стандартного образца гепарина, используется стандартный образец для проверки пригодности системы при анализе примесей гепарина Почему в первом анализе используется обычная вода, а во втором - дейтерированная? Возможно ли определение любых примесей в гепарине предложенным методом Что такое стандартный образец Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ XII (ОФС 42-0046-07)
НД Гепарин натрия субстанция- порошок П N 015882/01-010310.
ФСП «Эноксапарин натрия субстанция- порошок ЛСР-005292/10-080610. Фармацевтическая химия : Учеб. пособие / Под ред.
А.П. Арзамасцева. – е изд, испр- М. : ГЭОТАР-Медиа,
2005.- 640 с. Введение в фармацевтическую химию : Учеб. пособие /
Н.В. Логинова, Г.И. Полозов. – Минск : БГУ, 2003. – 250 с.
Чудинов МВ. Применение
1
Н-ЯМР-спектроскопии для структурного анализа органических соединений. М
МИТХТ. 2005.

67 Работа 5. Определение содержания антоцианов методом рН-дифференциальной спектрофотометрии. Теоретические основы метода Уменьшение величины монохроматического излучения, проходящего через гомогенную поглощающую среду, количественно описывается законом Бугера-
Ламберта-Бера: ТА) где Т – пропускание Т = I/I
o
;
I – интенсивность прошедшего монохроматического излучения
I
o
– интенсивность падающего монохроматического излучения
ε – молярный показатель поглощения с – молярная концентрация вещества в растворе
b – длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах. Величина Т) носит название оптической плотности, обозначается буквой Аи является измеряемой величиной. В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (А) пропорциональна концентрации вещества в растворе (си толщине слоя (b). Величина представляет собой удельный показатель поглощения, те. оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 гл (1 г мл) в кювете с

68 толщиной слоя 1 см. Величины и ε связаны соотношением. Измерение оптической плотности. Если нет других указаний в частной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 ± 1) С по сравнению стем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора приданной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,4 и желательно, чтобы она была менее 0,2. Для снижения величины ошибки при определении оптической плотности концентрация раствора (а иногда и толщина слоя) подбираются таким образом, чтобы оптическая плотность в исследуемой спектральной области находилась в пределах от 0,2 до 0,8. Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ордината длина волны или некоторая функция длины волны – по оси абсцисс. Если в частной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм. Приборы. Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей

69 монохроматическое излучение в области от 190 до
780 нм и обеспечивающей его прохождение через образец, и устройства для измерения оптической плотности. Основными частями этих приборов являются источник излучения, диспергирующий прибор (призма или решетка, щель для выделения полосы длин волн, кюветы для образцов, детектор излучаемой энергии, встроенные усилители и измерительные приборы. Проверка шкалы длин волн в УФ и видимой области. Точность калибровки прибора по шкале длин волн в спектральном ряду проверяют по приведенным в табл.
12.1.1 спектральным линиям водородной (Hβ) или дейтериевой (Dβ) разрядной лампы, линиям паров ртути
(Hg) кварцево-ртутной дуговой лампы, а также по максимумам поглощения раствора гольмия перхлората
(Ho) (готовый реактив для калибровки спектрофотометра представляет собой 4 % раствор гольмия оксида (Г) в
1,4 М растворе хлорной кислоты (Х. Допустимое отклонение составляет ± 1 нм для ультрафиолетовой и ± 3 нм для видимой области. Шкала длин волн может быть калибрована также при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют фиксированные полосы поглощения в видимой и УФ- областях, а также стандартных стекол, содержащих дидим смесь празеодима и неодима, и стекол, содержащих гольмий. Проверка шкалы оптической плотности. Для проверки шкалы оптической плотности используют стандартные неорганические стеклянные фильтры или

70 раствор калия дихромата (К) при длинах волн, указанных в табл. 12.1.2, где для каждой длины волны приведено точное значение удельного показателя поглощения и допустимые пределы. Раствор калия дихромата готовят следующим образом от 57,0 до 63,0 мг (точная навеска) калия дихромата, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре
130 С, растворяют в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000 мл. Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть обнаружен приданной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов например, оптическая плотность раствора 12 гл калия хлорида (Кв кювете с толщиной слоя 1 см при
200 нм при использовании воды в качестве раствора сравнения должна быть больше 2. Разрешающая способность для качественного анализа. Если есть указание в частной статье, определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02 % (об/об) раствора толуола (Т) в гексане (Г. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в частной статье. Кюветы. Допустимые отклонения в толщине слоя используемых кювет должны быть не более ±0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого раствора и

71 раствора сравнения, должны иметь одинаковое пропускание или оптическую плотность) при заполнении одними тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать. Требования к растворителям. Для определений, производимых в ультрафиолетовой и видимой областях, образец анализируемого вещества растворяют в соответствующем растворителе, который должен быть оптически прозрачным в используемой области длин волн. Для этих областей длин волн пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры и разбавленные растворы сильных кислот и щелочей. Приборы. Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиями оснащенные аналоговым резистентно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо. Разрешающая способность. Если указано в частных фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 гл толуола (Т) в метаноле (М, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и
268 нм, в соответствии с рис. 12.1.1. Если нет других

72 указаний в частных фармакопейных статьях, отношение А должно быть не менее 0,2. Цель работы осуществление пробоподготовки анализируемых образцов определение оптической плотности анализируемых проб (до шести измерений на одну пробу проведение расчетов, статическая обработка доверительный интервал, стандартное отклонение сопоставление полученных данных с показателями регламентируемыми нормативной документацией выводы о соответствии (или несоответствии) субстанции, заявляемым параметрам. Согласно ТУ 9197-001-40393587-2013 содержание антоцианов не менее 12 мг на содержимое капсулы 350 ±35 мг. Реактивы, оборудование и их характеристика Спектрофотометр СФ-26, СФ-104 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн от 200 до 900 нм, допустимая абсолютная погрешность измерения коэффициента пропускания - не более 1%. Кюветы кварцевые для спектрофотометрии с длиной оптического пути 10 мм. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц. Аппарат для встряхивания проб по [
2
]. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,1 мг. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,5 мг.

73 рН-метр с диапазоном измерений рН от 2 до 18; погрешность измерений ±0,01 ед. рН; Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2 по ГОСТ Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или
5-2-25 по ГОСТ Вода дистиллированная по ГОСТ Натрий уксуснокислый по ГОСТ 199
, ч.д.а. Калий хлористый по ГОСТ 4234
, ч.д.а. Кислота соляная по ГОСТ Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическими техническим характеристиками обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных. Проведение измерений
1 Условия проведения измерений Измерения проводят в следующих лабораторных условиях температура окружающего воздуха (25±5) С атмосферное давление (97±10) кПа; относительная влажность (65±15)%; частота переменного тока (50±5) Гц напряжение в сети (220±10) В.
2 Подготовка к проведению определения методом
рН-дифференциальной спектрофотометрии
.2.1 Подготовка буферных растворов а) Подготовка буферного раствора c рН=1,0 Для приготовления буферного раствора c рН=1,0 помещают 1,49 г хлористого калия KCl в мерную

74 колбу вместимостью 100 мл , доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для приготовления раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCl)=0,2 моль/дм
3
( моль/л) в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 75 мл дистиллированной воды, осторожно приливают 1,7 мл см концентрированной соляной кислоты HCl, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Затем в стакане вместимостью 100 мл (см
3
)смешивают 25 мл(см
3
) полученного раствора KCl с 67 мл см раствора HCl молярной концентрации 0,2 моль/дм
3
. При необходимости значение рН полученного буферного раствора доводят до 1,0 концентрированной соляной кислотой. б) Подготовка буферного раствора c рН=4,5 Для приготовления буферного раствора c рН=4,5 растворяют 1,64 г уксуснокислого натрия, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл , (см доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Доводят значение рН раствора до 4,5 концентрированной соляной кислотой. Срок хранения буферных растворов - не более 3 мес.
2.2 Подготовка проб для анализа а) Определение массовой концентрации суммы антоцианинов в жидких составах, не содержащей нерастворимые вводе вещества, проводят следующим образом. В две мерные колбы вместимостью 25 мл(см
3
) каждая помещают по
1 мл(см
3
) пробы и доводят до метки буферными растворами c pH 1,0 и 4,5, приготовленными в

75 соответствии с. Растворы перемешивают, выдерживают в течение 15 мини проводят измерение оптической плотности при длинах волн 510 и 700 нм. Измерение оптической плотности при 700 нм проводят для установления величины поглощения света посторонними примесями в анализируемой пробе. б) Определение массовой концентрации суммы антоцианинов в твѐрдых составах, не содержащей нерастворимые вводе вещества, проводят следующим образом. Подготовка проб для анализа. В мерную колбу вместимостью 100 мл(см
3
) помещают 5,0 г (точная навеска) тщательно растѐртого содержимого таблеток или капсул см. п. 6.2.4). Добавляют 50 мл(см
3
) дистиллированной воды, взбалтывают, проводят обработку на ультразвуковой ванне типа Сапфир в течение 5 мин при мощности 90-100%, затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают Раствор А. В мерную колбу вместимостью 25 мл(см
3
) наливают 1 мл см приготовленного раствора Аи доводят до метки буфером рН=1 (Раствор Б. В мерную колбу вместимостью 25 мл(см
3
) наливают 1 мл см приготовленного раствора Аи доводят до метки буфером рН=4,5 (Раствор В) Примечание Значения оптической плотности растворов Б и В должны находиться в пределах 0,2-1,0 mAU. Если растворы сильно окрашены и имеет большую оптическую плотность, то их

76 разбавляют в необходимое число раз. Растворы Б и В должны иметь одинаковое разведение. Испытуемый раствор должен быть прозрачным. Испытания проводят в соответствии с требованиями
ГФ XII, ч. 1, с. 98.
3 Выполнение спектрофотометрических измерений Измерения оптической плотности подготовленных проб проводят на спектрофотометре при длинах волн
510 и 700 нм. Измеряемой величиной является разность в оптической плотности растворов с рН 1,0 и
4,5 при длинах волн 510 и 700 нм, которая пропорциональна массовой концентрации (массовой доле) антоцианинов в исследуемом растворе. Пробы анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 подраздели ГОСТ Р ИСО 5725-2
4 Обработка результатов спектрофотометрических измерений Вычисления содержания суммы антоцианинов проводят до третьего десятичного знака в следующем порядке Оптическую плотность суммы антоцианинов (А) рассчитывают как разность оптических плотностей растворов Б и В при разных длинах волн и значениях pH по формуле




5 4
700 510 0
1 700 510






рН
рН
А
А
А
А
А
Массу суммы антоцианинов
)
(
антоционин
С

, мг , рассчитывают в пересчѐте на цианидин-3-глюкозид по формуле

77
 
m
)
(
ср








m
l
V
F
X
M
A
С
антоционин

где
A
- оптическая плотность суммы антоцианинов, mAU;
 
X
M
- молекулярная масса цианидин-3-глюкозида, равная 449,2 г/моль;
F
- величина разведения
V
- объем раствора А, л
m
- масса анализируемой пробы, г m
ср
- средняя масса таблетки или содержимого капсул, мг.

- молярный коэффициент экстинкции цианидин-3- глюкозида, равный 26900 [моль·см/л]
-1
l
- длина оптического пути кюветы, равная 1 см.
m
F
A
m
F
A
С
антоционин













84
,
598
m
92
,
44
m
1 26900 1
,
0 2
,
449
)
(
ср ср
Расхождение между двумя параллельными определениями (в процентах от среднего значения, выполненными в условиях повторяемости, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) при вероятности 0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений , округленное до второго десятичного знака. Контрольные вопросы по теме Контроль качества фармацевтических препаратов и субстанций – как неотъемлемая часть фармацевтического производства. Нормативная документация на препарат. Спектрофотометрия.

78 Подготовка фотометра к работе. Закон Бугера-Ламберта-Бера. Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ XII ГОСТ Р 53773-2010 Методы определения антоцианинов ТУ 9197-001-40393587-2013 . Биологически активная добавка к пище «Тауфон
Черника» Работа Определение цветности субстанции
Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5. Цель работы осуществление пробоподготовки анализируемых образцов определение оптической плотности анализируемых проб (шесть измерений на одну пробу проведение расчетов, статическая обработка доверительный интервал, стандартное отклонение сопоставление полученных данных с показателями регламентируемыми нормативной документацией выводы о соответствии (или несоответствии) субстанции, заявляемым параметрам. Реактивы, оборудование и их характеристика Субстанция Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5 ; химическое название поли-(О-2-гидроксиэтил)крахмал Структурная формула

79
R=R
1
=H; CH
2
CH
2
OH (степень молярного замещения от
0,43 до 0,55) Средняя молекулярная масса от 180000 до 290000. Вода дистиоированная (очищенная. ГОСТ 6709-72. Мерная колба 100 мл. ГОСТ 1770-74 Весы лабораторные. ГОСТ 24104-2001 Спектрофотометр Кюветы для измерения оптической плотности Методика определения Испытуемый раствор должен быть прозрачным. Испытания проводят в соответствии с требованиями
ГФ XII, ч. 1, с. 98. Приготовление испытуемого раствора 5,0 г испытуемой субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в горячей воде (не выше
+50 С, охлаждают до комнатной температуры (22 ± 2 С, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Оптическая плотность испытуемого раствора, измеренная в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 450 ± 1 нм. В соответствии с нормативной документацией на
Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5 оптическая плотность должна быть не более 0,025. В качестве раствора сравнения используют воду. Контрольные вопросы по теме Контроль качества фармацевтических препаратов и субстанций – как неотъемлемая часть фармацевтического производства. Нормативная документация на препарат. Спектрофотометрия. Подготовка фотометра к работе. Закон Бугера-Ламберта-Бера.

80 Нормативная документация, литература по теме лабораторной работы
ГФ XII
НД «Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5 » субстанция.
ФСП «Гидроксиэтилкрахмал 200/0,5» субстанция.
ЛСР-007746/09-021009 Работа 7. Определение удельного оптического вращения и количественное определение основного вещества в субстанции гидроксиэтилкрахмала

1   2   3   4   5