ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 20.11.2021
Просмотров: 195
Скачиваний: 2
Полные 6-мерные биочипы были также использованы для выявления специфичности ДНК-связывающихся соединений к определенным нуклеотидным последовательностям. Таким способом была изучена специфичность гистоноподоб-ного бактериального белка HU, низкомолекулярного красителя Хекст 33258, а также белка р50, являющегося регулятором транскрипции и трансляции и открытого группой академика Л.П. Овчинникова (рис. 3).
Рис. 3. Идентификация узнавания белком Р50 специфичных участков в ДНК
Флуоресцентно окрашенный белок Р50 связывается с полным 6-мерным олигонуклеотидным микрочипом. Проводиться измерение флуоресценции белка на каждом элементе биочипа в градиенте повышающейся температуры и ТD -температур плавления комплексов белка с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды микрочипа, проявляющие наибольшую температурную стабильность в комплексе с ДНК, локализованные в светлом кресте и содержащие тетрануклеотидные последовательности TGGT и GGTC, демонстрируют также и наибольшую специфичность связывания
Гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами служит для качественной и количественной идентификации нуклеиновых кислот и для анализа структурных вариаций в них. Рибосомы присутствуют во всех живых клетках, а рибосомальные РНК являются одними из наиболее эволюционно консервативных макромолекул. Вместе с тем в рибосомальных РНК существуют несколько вариабельных участков. Различия в нуклеотидной последовательности этих участков применяются для идентификации микроорганизмов и для прослеживания их эволюции. Нами разработан ряд микрочипов для экспрессного метода идентификации нитрифицирующих бактерий, бактерий групп Bacillus и архебактерий. Присутствие рибосомальных РНК в клетке в количестве тысяч копий позволяет проводить анализ в ряде случаев без их амплификации. Разработана также простая система выделения рибосомальных РНК и их флюоресцентного мечения на одной и той же колонке, что позволило создать биочипный экспресс-метод анализа таких типов биологического оружия, как сибирская язва. Мы изучаем также возможность создания биогенов для идентификации всех или большей части известных микроорганизмов.
Для качественного и количественного анализа экспрессии генов и содержания различных информационных РНК существует несколько зарубежных коммерческих биочипных систем. Гелевые микрочипы были использованы нами также для анализа мРНК, например, для идентификации хромосомных перестроек, вызывающих восемь различных типов лейкемий. Соответствующая микрочипная диагностика лейкемий внедрена в Детском республиканском гематологическом центре.
Олигонуклеотидные микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, достаточных для проведения их гибридизационного анализа.
В более традиционном и простом подходе амплификация ДНК и гибридизация амплифицированной ДНК с биочипом проводятся в две отдельные стадии. Такие двухстадийные методы были разработаны нами в совместных исследованиях с рядом российских и зарубежных лабораторий для идентификации мутаций в b-глобиновом гене, вызывающем наследственное заболевание b-талассемию, определения аллелей в гене гистосовместимости HLA DQAI, нуклеотидного полиморфизма в гене m-опиоидного рецептора, обуславливающего, вероятно, склонность к наркомании, определения ряда бактериальных генов, ответственных за резистентность к антибиотикам и синтез некоторых токсинов.
Гибридизация амплифицированной ДНК с reлевыми биочипами нашла применение в практике для идентификации мутаций, ответственных за резистентность туберкулезных бацилл к одному из основных противотуберкулезных препаратов - рифампицину. Этот метод прост, недорог и ускоряет анализ от нескольких недель до 1 дня. Метод был разработан совместно с Московским научно-практическим центром борьбы с туберкулезом и ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор" и опробован более чем на 150 больных в ряде клиник. Налажен коммерческий выпуск таких наборов для анализа, содержащих олигонуклеотидные микрочипы, компоненты для амплификации ДНК, включая синтетические флюоресцентно меченные олигонуклеотиды, клинический анализатор биочипов с портативным компьютером и программой для автоматического анализа биочипов. Этот метод нетрудно адаптировать для обнаружения многих других микроорганизмов, генов лекарственной резистентности и синтеза токсинов, а также для идентификации различных мутаций в вирусах, микроорганизмах, животных (включая человека) и растениях. Введение соответствующих изменений, необходимых для выполнения этих задач, можно провести за короткое время - от нескольких недель до нескольких месяцев.
В двух других разработанных методах гибридизацию на микрочипе объединяют с амплификацией на микрочипе в одну стадию, что ускоряет и упрощает анализ. Во втором методе амплификация происходит параллельно в растворе в реакционной камере и в гелевых элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные и участвующие в амплификации олигонуклеотиды (праймеры). Такой подход был был использован для сокращения идентификации туберкулезной бациллы до 2 часов и определения ее резистентности сразу к двум лекарственным препаратам - рифампицину и изониазиду. В методе используется также аллель-специфичная амплификация, протекающая на иммобилизованных в геле олигонуклеотидах. Помимо этого, мутации и полиморфные нуклеотиды могут выявляться с помощью ферментативных реакций удлинения иммобилизованных на чипе олигонуклеотидов на один нуклеотид и их соединения с другими олигонуклеотидами - лигирования.
В третьем методе амплификация происходит исключительно в гелевых элементах микрочипа, используемых в этом случае как пробирки объемом от нескольких нанолитров до долей микролитра. Каждая из этих гелевых нанопробирок содержит необходимые для амплификации два и более специфических олигонуклеотида. Метод пока достаточно сложен в исполнении и требует дальнейшей доработки. Однако его реализация позволит анализировать на одном биочипе и в одном эксперименте тысячи полиморфных нуклео-тидов в геноме, что позволит использовать его для массового скрининга популяций. Известно, что полиморфизм примерно 3 млн. нуклеотидов из 3 млрд., составляющих человеческий геном, отличает одного человека от другого. Полиморфизм отвечает за наследственные дефекты и патологии, предрасположенность ко многим заболеваниям, в том числе злокачественным, и определяет многие Другие генетически заданные особенности человека. Поэтому создание простого и эффективного микрочипного анализа полиморфизма сразу по многим участкам для каждого индивидума приблизит человека к цели "Познай самого себя", начертанной приблизительно 2500 лет назад на стене Дельфийского храма в Греции.
Биочипы, разработанные для идентификации некоторых патогенных бактерий, вирусов и биологического оружия, а также для обнаружения мутаций, вызывающих раковые заболевания а - вируса натуральной оспы, осповакцины, оспы коров;
б - сибирской язвы, чумы, бруцеллеза на одном чипе;
в - детекция патогенов в донорской крови;
г - мутации в ген brcal, ответственных за возникновение рака молочной железы;
д - транслокаций при лейкозах
Некоторые из этих биочипов могут быть использованы для быстрого и чувствительного выявления биологического оружия, оспы, сибирской язвы и других подобного рода болезней.
Технология производства микрочипов позволяет с небольшими изменениями получать как олигонуклеотидные и ДНКовые, так и белковые микрочипы, содержащие ферменты, антитела, антигены и т.д. Стабилизирующий эффект иммобилизации в геле позволяет хранить большинство белковых микрочипов в течение месяцев без потери функциональной активности.
В сотрудничестве с лабораториями членов-корреспондентов РАН Е.В. Гришина и В.А. Несмеянова (ИБХ, РАН), а также А.Ю. Барышникова (Онкоцентр РАМН) нами было продемонстрировано эффективное применение белковых гелевых чипов для количественной диагностики ряда токсинов, а также раковых антигенов и антител в крови пациентов. Эти начальные эксперименты свидетельствуют, что биочипы конкурентоспособны в клинической иммунодиагностике со стандартными методами.
Перспективно использование белковых чипов в бурно развивающейся протеомике. В этой связи особый интерес представляют следующие две задачи:
• качественное и количественное определение параллельно большого количества белков в клетках различных тканей или в различных функциональных состояниях, для чего можно использовать специфические антитела, как продемонстрировано на рис. 7, для количественной идентификации антигена рака простаты; в ряде стран уже развернуты программы получения большинства белков человеческих и бактериальных клеток и производства специфических антител к ним; мы надеемся использовать отечественную биочипную технологию для сотрудничества с этими программами с целью создания системы количественного определения клеточных белков;
• изучение взаимодействий клеточных белков друг с другом и другими клеточными лигандами, такими как ДНК и низкомолекулярные соединения; определение специфичности ДНК связывающихся белков с помощью полных олигонуклеотидных микрочипов описано ранее; значительно более сложной задачей является идентификация белков, специфически взаимодействующих друг с другом и лигандами, если хотя бы один компонент неизвестен; для этих случаев разработан метод идентификации связывающихся с микрочипом молекул с помощью масс-спектрометрии; на белковых микрочипах, содержащих иммобилизованные ферменты, можно проводить также кинетический анализ их субстратов и ингибиторов.
КЛЕТОЧНЫЕ МИКРОЧИПЫ
Многие прокариотические и эукариотические клетки, как известно, сохраняют свою жизнедеятельность и даже могут делиться, будучи фиксированы в гидрогеле. Это открывает ряд интересных возможностей, в том числе для создания клеточных биочипов как матричных биосенсоров для параллельного определения, например, ряда антибиотиков и ксенобиотиков. Бактериальный микрочип , содержащий иммобилизованные и резистентные к различным антибиотикам штаммы Е. сoli. Фотография прокрашенного гелевого элемента свидетельствует о распределении растущих клеток по всему объему геля. Кинетика деления и роста бактерий в геле микрочипа регистрируется окрашиванием клеток флюоресцентной краской. Рост бактерий зависит от резистентности клеток к антибиотику и его присутствия в среде. Рисунок показывает бактериальный микрочип, содержащий иммобилизованные в геле 4 штамма Е. coli, чувствительные и резистентные к антибиотикам тетрациклину, хлорамфениколу и смеси хлорамфеникола и ампициллина. Подавление роста бактерий в соответствующих элементах биочипа позволяет идентифицировать присутствие этих антибиотиков в среде. После построения калибровочной кривой содержание антибиотиков в среде может быть измерено количественно. Представляет интерес также создание микрочипов, содержащих животные и растительные клетки для определения широкого диапазона различных веществ в окружающей среде.
* * *
Развитие технологии биочипов в Институте молекулярной биологии РАН стало возможным благодаря тесному сотрудничеству исследователей различных специальностей - биологов, химиков, физиков, инженеров, математиков. Эта многогранность была заложена уже при создании института его основателем, академиком В.А. Энгельгардтом. В развитии биочипов участвует в той или иной степени более 12 групп и лабораторий института. Кроме того, с 1991 г. нами проводились совместные исследования и разработки с более чем 40 отечественными и зарубежными исследовательскими и производственными лабораториями и фирмами. Благодаря относительной самодостаточности нам удается продолжать успешную работу и в нынешние, весьма нелегкие для российской науки времена.
Развитие отечественной технологии гелевых биочипов и ее различных практических приложений, начатое с 1989 г., получило значительную поддержку, в том числе финансовую, как в России, так и в США со стороны ряда государственных и частных организаций. Эффективность реализации этих затрат будет определяться широтой и масштабностью использования отечественной технологии в фундаментальных исследованиях и в приложениях в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве, для мониторинга окружающей среды и для борьбы с биотерроризмом. С этой целью при активной поддержке Президиума РАН создается Центр коллективного пользования технологией биологических микрочипов при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Центр будет предоставлять отечественную технологию биочипов сотрудникам РАН, а также и другим государственным и частным учреждениям.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Биочип трудно заметить невооруженным глазом. Это едва заметный матовый квадратик на блестящей черной пластинке, размер которой не больше обычной почтовой марки. Но, похоже, этот кроха способен перевернуть всю медицину. Ведь биочип в состоянии заменить целую лабораторию с ученым штатом, сотнями приборов. Принцип действия такого чипа основан на молекулярной биологии.
ББиочипы используются для самых разных целей. Очень быстро определить наличие в окружающей среде болезнетворных микробов. В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза. Еще одно очень важное медицинское применение биочипов – это диагностика лейкозов и других раковых заболеваний. Биочипы позволяют быстро, за считанные дни или даже часы различать внешне неразличимые виды лейкозов. При одних пациентах можно быстро и эффективно вылечить современными лекарствами. При других – не стоит даже пробовать, надо сразу делать пересадку костного мозга. Врачи не могут быстро отличить эти лейкозы друг от друга, а стратегию лечения надо правильно выбирать с самого начала. Также биочипы позволяют сразу отличить две формы рака груди – легко излечимую и плохо излечимую. Биочипы применяются и для диагностики других видов рака.
Биочип для обнаружения спор сибирской язвы срабатывает за полчаса, а традиционный метод занимает полсуток, что в экстренных случаях многовато. Быстро можно провести анализ многих инфекций и генетических мутаций.
Исследования
помогают создать новые лекарственные
препараты и быстро выяснить, на какие
гены и каким образом эти новые лекарства
действуют. Биочипы являются также
незаменимым инструментом для биологов,
которые могут сразу, за один эксперимент,
увидеть влияние различных факторов
(лекарств, белков, питания) на работу
десятков тысяч генов.