Файл: Биотехнология, ее роль в нтп. Основные направления. Генетическая инженерия, понятие о гене и способы его получения.pdf

продукции в
максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования
(посевная доза,
температура,
рН,
окислительно-восстановительный потенциал,
аэрация,
массообменные характеристики, питательные и ростовые добавки , сроки культивирования ) .
Выращивание проводят в ферментаторах (культиваторах), вместимость которых может варьировать от 2 л до 100-400 м3 в зависимости от потребности в продукте. Для получения культур животных клеток объем ферментаторов пока не превышает 3 м3. В настоящее время биотехнологическая промышленность оснащена ферментаторами, позволяющими вести процесс в автоматическом режиме с программным управлением. Процесс культивирования ведется в асептических условиях,
чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.
Помимо суспензионного (глубинного) культивирования в ферментаторах иногда применяют поверхностное культивирование на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток).
Последний способ осуществляется в роллерных (вращающихся) установках.
Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают затем переработке, сущность которой определяется технологией получения целевого продукта. Наиболее типовыми являются следующие процессы:
● концентрирование биомассы (сепарированием, центрифугированием) и приготовление из него жидкого (суспензии, пасты) или сухого продукта;
● высушивание,
которое проводится лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха. Для этого существуют специальные лиофильные аппараты (в том числе ленточные автоматические сушилки большой мощности) и распылительные сушилки, в том числе экологически чистые, так как процесс ведется в замкнутом цикле. Последние имеют большую мощность, однако не позволяют сушить термолабильные продукты;
12

● сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из него целевого продукта, например антигенов, токсинов, инсулина и др. Иногда предварительно прибегают к дезинтеграции (разрушению) клеток механическим способом или с помощью ультразвука, осмоса, чтобы увеличить выход целевого продукта.
В тех случаях, когда из биомассы или центрифугата (культуральная жидкость)
необходимо выделить активную субстанцию
–
витамин,
аминокислоту, антиген, антитело, фермент и пр., применяют физические или физико-химические методы очистки. Выбор их определяется свойствами выделяемого вещества (природа, молекулярная масса, лабильность к внешним воздействиям, химическое сродство и т.д.). Из физических методов чаще всего применяют на первичных стадиях сепарирование,
центрифугирование
(ультрацентрифугирование),
а из физико-химических
- осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, а также ультрафильтрацию,
хроматографию, электрофорез. Методы выделения и очистки, как правило,
многоступенчатые. Чистоту получаемого продукта характеризуют наличием в нем примесей и выражают коэффициентом очистки, который представляет отношение числа активных единиц продуктов на 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного неочищенного продукта.
Обычно в препаратах активная субстанция не всегда находится в предельно очищенном состоянии,
поскольку в
производственных условиях при переработке больших объемов сырья и существующих методах очистки этого добиться пока не удается. Поэтому иммунобиологические препараты,
полученные как традиционным методом, так и способом генетической инженерии, содержат, как правило, примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и не- специфические компоненты - продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества. Они не только бесполезны для препаратов, но иногда вызывают нежелательные побочные реакции организма
13

при применении препаратов (местные реакции, повышение температуры тела,
аллергические проявления). В принципе необходимо стремиться к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в предельно очищенном состоянии.
После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат. В соответствии с назначением и способом применения он может быть в жидком или сухом состоянии (раствор, суспензия, порошок) или в виде мазей.
Препарат может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения. В зависимости от этого препарат может быть стерильным и нестерильным.
Конечный препарат обычно содержит, помимо примесей, от которых не удалось освободиться, необходимые добавки: консервант (антисептик для поддержания стерильности препарата при хранении), стабилизатор (обычно инертные белки, аминокислоты для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении), активаторы (например, адъюванты и иммуномодуляторы в вакцинах). В конечной композиции препарат фасуется
(ампулы, флаконы, таблетки, мази), этикетируется, снабжается инструкцией по применению.
Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией (технические условия, технологический регламент на изготовление)
на производстве и
в
Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А.
Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.
Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии.
Генетическая инженерия является основой биотехнологии. Генетическая инженерия по существу сводится к генетической рекомбинации, т.е. обмену генами между двумя хромосомами, которая приводит к возникновению клеток
14

или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в следующем:
● выделение Д Н К из разных видов организмов или клеток;
● получение гибридных молекул ДНК;
● введение рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;
● создание условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.
Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются (клонируются) из хромосом или плазмид, прицельно расщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или синтезируются химически.
Набор ферментов (известно более 500 рестриктаз), способных резать Д Н К по определенным связям (сайтам), является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК. Эти ферменты названы рибозимами. Их роль еще пока не выяснена.
С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены.
Для этого вначале расшифровывают число и
последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному геку.
Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги,
вирусы человека, животных и растений.
Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен, причем чем большие размеры имеет плазмида, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ам-поликации генов, .т е. увеличения числа копий
15

определенного гена в клетке, можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой. Ампфликацией удается добиться получения до 3000 копий плазмидных генов на клетку.
Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда,
который содержит ДНК, состоящую из 50 тыс. пар нуклеотидов. Преимущество фага ламбда перед плазмидами в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.
В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды,
представляю- щие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используются для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот.
Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной иРНК.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют E.
coli, B. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования,
экологической безопасности.
Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чуже- родного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала.
Такие штаммы - суперпродуценты це- левых продуктов - уже получены и применяются в биотехнологической промышленности; они носят название промышлен- ных штаммов. В качестве примера можно привести штаммы - суперпродуценты интерферона, интерлейкина, белков ВИЧ и др. Некоторые
16

штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях приходится применять дезинтеграцию (разрушение) клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.
В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить, вернее собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. Это прежде всего относится к низкомолекулярным пептидам.
С целью повышения уровня секреции целевого белка пользуются следующим приемом: к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой реципиента. Образующийся в результате такой манипуляции химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Возможно также к гену целевого белка присоединить ген-индикатор, .т е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него - целевой белок. В качестве индикатора можно использовать, например, галактозидазу.
17

Заключение
Биотехнологии — это использование живых организмов, их отдельных составляющих (ДНК, микроорганизмов, клеток и их частей) или продуктов их жизнедеятельности для производства продуктов и решения технических задач.
Сегодня существуют три главных вектора работы биотехнологов:
● сельское хозяйство, в частности создание ГМО
● энергетика и промышленность, например получение биотоплива или производство веществ, способных к деградации токсических отходов
● медицина — специалисты в области биотехнологий работают над созданием препаратов для лечения тяжелых и неизлечимых заболеваний
Она преследует две основные цели: анализ патогенеза заболевания на молекулярном уровне и производство лекарств на базе генетических модификаций микроорганизмов и клеток организма.
18

Список литературы:
1. Биотехнология: учеб. пособие для студ. выст. учеб. заведений / Ю. О.
Сазыкин, С. Н. Орехов, и. И. Чакалена : под ред. А. В. Калинского. - 3-е изд. , стер. М. : Издательский центр «Академия», 2008. - 256 с.
2. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. «Основы биотехнологии»,
Academia/ Москва - 2005 3. Воробьёв А. А. Медицинская и санитарная микробиология : учеб.
пособие / Воробьёв А. А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В. П. . - М. :
Академия 2010 . - 462 с. : ил., 8 л. цв. ил. .- Высшее профессиональное образование.
4. Щелкунов С.Н. «Генетическая инженерия», сибирское универсальное издательство. Новосибирск - 2004.
5. Микробиология с вирусологией и иммунологией/ Павлович С.А. -
Минск: Высшая школа, 2008 г… Студентам высших учебных заведений.
19