ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 02.12.2023
Просмотров: 39
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический[8].
Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим, и может находиться только в одной из фаз.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем [8]. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.
Ковалентная поперечная сшивка
Суть метода: при введении в раствор фермента бифункционального сшивающего агента отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами служат сами молекулы фермента.
Получают нерастворимые агрегаты ферментов– более эффективные гетерогенные катализаторы.
Cшивающие агенты: глутаровый альдегид, диизоцианат, хлорпроизводные триазина[8].
Сшивка ферментов преимущественно осуществляется за счет аминогрупп.
Метод отличается простотой реализации и позволяет производить сшивку различных по структуре ферментов, а также ферментов с целыми клетками
Примеры сочетания методов иммобилизации:
- адсорбция на носителе + инкапсулирование;
- включение в гель + адсорбция;
- адсорбция + поперечная сшивка
Ни один из методов иммобилизации не является универсальным, и для каждого типа биокатализаторов существуют свои предпочтительные методы.
Чаще всего ферменты иммобилизуют различными адсорбционными методами или методом поперечных сшивок, лучшим методом для иммобилизации целых клеток является включение в полимерные структуры.
Вопрос 5. Выделение, подбор и селекция объектов для биотехнологического процесса
В биотехнологии и микробиологии часто пользуются терминами «вид», «штамм», «клон», «чистая культура». Поэтому необходимо дать их характеристику.
Вид– основная таксономическая(классификационная) единица, представляет собой совокупность особей одного генотипа, обладающих хорошо выраженным фенотипическим сходством. Вид подразделяют на подвиды, или варианты[3].
Штамм– это культуры микроорганизмов одного и того же вида, выделенные из различных природных сред (почв, водоемов, организмов) или из одной и той же среды, но в разное время. Разные штаммы одного вида микроорганизмов могут различаться по некоторым признакам, например, чувствительности к антибиотикам, способности синтезировать некоторые продукты метаболизма и т.д., но эти различия выражены в меньшей степени, чем видовые[3].
Клон(в микробиологии = колония)– совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки[3].
Чистая культура–совокупность (популяция) микроорганизмов, состоящая из особей одного вида[3].
Мир микроорганизмов велик и многообразен. В настоящее время известно более 100 тыс. различных видов. Однако микроорганизмов, синтезирующих продукты или осуществляющих реакции, полезные для человека, несколько сотен видов. При столь большом разнообразии микробов возникает вопрос, каким образом подобрать именно те формы, продукция которых интересует?
Для этого проводится выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест, где обитание того или иного продуцента наиболее вероятно. Например, углеводородокисляющие микроорганизмы встречаются в почве возле бензоколонок, а винные дрожжи – на винограде. Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального состава (элективные). В элективных средах путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития определенного продуцента. Таким образом, получают накопительные культуры микроорганизмов.
Следующий этап – выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента.
Другой путь подбора микроорганизмов – из имеющихся коллекций микроорганизмов. Например, продуцентов антибиотиков чаще всего находят среди актиномицетов, а типичными продуцентами этанола являются дрожжи.
Главным критерием при отборе продуцентов является способность микроорганизмов синтезировать целевой продукт. Биотехнологическая промышленность предъявляет к продуцентам ряд требований:
1) микроорганизмы должны обладать высокой скоростью роста;
2) использовать для жизнедеятельности дешевые непищевые субстраты;
3) быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой.
Все это позволяет значительно снизить затраты на производство целевого продукта.
Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями синтетических процессов, чем высшие формы живого. Например, корова массой 500 кг в течение суток синтезирует около 0,5 кг белка. Такое же количество белка за одни сутки можно получить с помощью 5г дрожжей. Однако высокие скорости роста характерны не для всех микроорганизмов.
Особый интерес как биотехнологические объекты представляют фотосинтезирующие микроорганизмы. В своей жизнедеятельности они, используя энергию света, синтезируют разнообразные вещества в результате восстановления углекислоты, сопряженного с окислением воды (цианобактерии и эукариоты), способны к усвоению атмосферного азота (прокариоты), т.е. обходятся самыми дешевыми источниками энергии, углерода, восстановительных эквивалентов и азота. Фототрофные микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и различных биопрепаратов.
Другими привлекательными объектами для биотехнологии являются термофильные организмы, которые оптимально растут при высоких температурах (60-80°, 110° и выше), что затрудняет развитие посторонней микрофлоры. Среди термофилов существуют ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Применение термофилов позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования, а скорость роста и метаболическая активность у этих организмов в 1,5-2 раза выше, чем у мезофиллов[4].
Таким образом, выделение и подбор объекта – важный этап биотехнологического процесса. Однако путем простого подбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции, с помощью которых получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз.
Селекция – это направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Основной путь селекции – это путь от слепого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов[3].
Список литературы
1. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Беккер. - М.: Пищевая промышленность, 2005. - 248 c.
2. Девочкина Н.Л. Технология культивирования шампиньона на промышленной основе/Н.Л.Девочкина //Рекомендации, М.: Россельхозакадемия, 2004.- 400 с.
3. Дрыгин Ю.Ф. Англо-русский словарь по биотехнологии (с толкованиями) / Ю.Ф. Дрыгин, Е.С. Дрыгина, И.П. Пьянзина. - М.: Гостехиздат, 2015. - 336 c.
4. Найду Р. Микроэлементы в окружающей среде. Биогеохимия, биотехнология и биоремедиация. / Под редакцией М. Н. В. Прасада, К. С. Саджвана, Р. Найду. - М.: Физматлит, 2009. - 279 c.
5. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.-564 с.
6. Северин С.Е. Биохимия и медицина – новые подходы и достижения / С.Е. Северин. – М.: Русский врач, 2006. – 94 с.
7. Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия / Р. Шмид. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2014. - 328 c
8. Юрин В. М. Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин. Минск: БГУ, 2006, 245 с.