Файл: Клонирование и трансгеноз животных по дисциплине Современные проблемы биологии.doc
Добавлен: 03.12.2023
Просмотров: 651
Скачиваний: 9
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Основной целью развития методики клонирования животных является содействие их генетической инженерии (трансгенозу). Как правило, новая ДНК, предназначенная изменить гены животных, может вводиться лишь в совсем молодые эмбрионы, обычно на стадии одной или двух клеток. Но будут ли эти гены приняты зародышем, полностью зависит от случайности.Поэтому доля успешных экспериментов очень мала, а сам процесс очень трудоемкий. При клонировании ДНК вводится в выращенные в лабораторных чашках клетки, число которых достигает нескольких тысяч или даже миллионов. Затем появляется возможность определить, какие клетки интегрировали перенесенную ДНК, и лаборанты могут пересадить такие клетки в энуклеированные яйцеклетки в целях развития зародышей, содержащих модифицированную ДНК. Таким образом, клонирование животных представляло бы интерес для некоторых отраслей фармацевтической промышленности и производства продуктов питания, если бы смогло обеспечить постоянный выпуск высококачественной рыночной продукции, такой, как молоко или мясо, терапевтических белков из козьего или коровьего молока либо белка куриного яйца (так называемый "фарминг") или даже внутренних органов свиньи для пересадки человеку без риска отторжения его иммунной системой.В 1997 г. биотехнологическая компания PPL Therapeutics Inc. совместно с Рослинским институтом клонировала овцу по кличке Полли из генетически измененной зародышевой клетки. В молоке Полли содержится белок, вызывающий свертывание крови человека, который может быть использован для лечения гемофилии. Международные нормы регулирования такой методики пока что не установлены, а те или иные эксперименты по клонированию животных тем временем продолжаются.Сообщения об успешном клонировании животных привлекают внимание общественности, однако результаты, которых добиваются ученые, далеко не безупречны. Уровень выхода жизнеспособных клонированных эмбрионов зависит от биологического вида и типа используемых клеток, однако остается, как правило, очень низким. Даже при успешных родах у клонированного животного наблюдается целый ряд аномалий и дефектов, в том числе так называемый синдром большого (крупного) потомства: клонированные животные часто оказываются слишком крупными для нормальных родов, а плацента разрастается больше нормы. Такие дефекты пока что до конца не объяснены, но одной из возможных причин может быть неполное репрограммирование
4. Трансгеноз животныхТермин «трансгеноз» возник в начале 70-х годов, значительно ранее того момента, когда он стал использоваться в современном значении этого слова. Первоначально им обозначали перенос генов в клетки, растущие в культуре, т.е. invitro. В настоящее время этот термин используют применительно к переносу генов в целые организмы (система invivo), а сами такие генетически измененные организмы называют трансгенными.В 1980 г. Гордон с помощью микроинъекций "голой" ДНК в мужской пронуклеус зиготы мыши получил первых животных, содержавших в своем геноме искусственно введенную экзогенную ДНК. Такие животные в дальнейшем и были названы трансгенными, а сам процесс их получения - трансгенозом. Первоначальный вариант трансгеноза, использованный Гордоном, сейчас называют классическим (рис. 5).С развитием техники молекулярного клонирования генов число публикаций по получению и исследованию трансгенных мышей стремительно росло, постепенно расширялся спектр проблем и задач, решаемых с помощью трансгеноза. Одной из самых впечатляющих работ на ранних этапах развития трансгеноза были эксперименты Пальмитера с соавт. (1982) по микроинъекции в зиготы мышей гена гормона роста крысы, находящегося под контролем сильного промотора гена металлотиенина мыши МТ-1мыши. Перенос такого искусственного конструкта привел к ускоренному росту мышей и значительному увеличению веса трансформированных животных, развившихся из прооперированных зигот (рис. 6).Рисунок 5 - Классическая схема трансгеноза[3]Вскоре анализу экспрессии в организме мышей были подвергнуты сотни структурных генов, генов различных вирусов, онкогенов, антионкогенов и др. К середине 80-х годов были начаты эксперименты по созданию трансгенных сельскохозяйственных (с/х) животных. К этому времени были подобраны оптимальные условия для визуализации пронуклеусов зигот с/х животных, поскольку большинство зигот имеет значительное количество пигментных и жировых гранул, затрудняющих процесс микроинъекции.Попытки переноса гена гормона роста быка, овец, человека, гена рилизинг-фактора гормона роста человека (выход гормона роста в кровь находился под контролем эндогенных регуляторов) в дальнейшем были продолжены на зиготах овец, свиней, кроликов и рыбах как в нашей стране, так и за рубежом.
Рисунок 6 - Трансгенная мышь с геном гормона роста быка (слева) и контрольная [3]Трансгеноз открыл новые пути направленного изменения продуктивности разных видов с/х животных (повышение темпов роста, изменение количества и качества молока, шерсти, увеличение плодовитости), получения животных - биореакторов ценных биологически активных препаратов (таких как фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, гемоглобин и антитела в молоке, крови или моче), создание новых форм и пород животных, приспособленных к биомедицинским исследованиям, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплантации, пород, устойчивых к различным заболеваниям. В частности, с успехом для направленной экспрессии фармакологически ценных белков используются гены, кодирующие основные белки молока - казеины. В России, например, в 1999 г. были получены трансгенные мыши, экспрессирующие в молоко ценный медицинский препарат - гамма-интерферон человека (600 мкг гамма-интерферона на 1 мл молока). Соответствующая генетическая конструкция может быть использована для получения трансгенных коз, в молоке которых будет экспрессироваться лекарственный белок.Вместе с тем с самого начала работ по трансгенозу были выявлены некоторые сложности, связанные с этой технологией. В первую очередь процедура получения трансгенных животных пока еще остается малоэффективной. Трансгенные животные часто менее жизнеспособны, чем природные особи. Имеются проблемы и со стабильностью экспрессии трансгена. Все это, а также ряд других причин, включая настороженное отношение общественности к данной проблеме, и обусловили ту ситуацию, что до сих пор трансгенные животные (в отличие от трансгенных растений) находят пока лишь ограниченное применение в практике.Кроме традиционного (классического) способа введения чужеродной ДНК с помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы, получили развитие новые системы и способы переноса генов в геном животных (рис. 64). Они позволяют повысить эффективность трансгеноза, что особенно важно для дорогостоящих экспериментов в области биотехнологии с/х животных. Показано, например, что эффективность получения с помощью микроинъекций трансгенных коров, по меньшей мере, в 40 раз ниже, чем у мышей.Одним из таких альтернативных подходов является использование
сперматозоидов в качестве векторов для привнесения чужеродной ДНК в яйцеклетку при ее искусственном оплодотворении. Известно, что сперматозоиды ряда видов животных в отсутствие семенной жидкости способны захватывать чужеродную ДНК. Легкость и простота использования этого метода привели к многочисленным попыткам трансформировать таким образом геном мышей, свиней, крупного рогатого скота, овец, рыб, морского ежа, насекомых, птиц, шпорцевой лягушки, моллюсков. Необходимо отметить, однако, что существует опасность непреднамеренного введения экзогенного генетического материала, который может случайно находиться в окружающей среде, при использовании метода внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) в клиниках по искусственному оплодотворению человека. Показано также, что отмывка сперматозоидов человека после инкубации в растворе с ДНК вируса папилломы человека не приводила к полному удалению экзогенной ДНК из клеток. Часть ДНК прочно связывалось со сперматозоидами и интернализовалась вместе с ними.Еще одним подходом, обеспечивающим увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Чтобы избежать опасности неконтролируемого распространения ретровирусов, используют дефектные по репликации вирусные векторы с вирусом-помощником.Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Однако успешная интеграция вирусного генома с хозяйским геномом происходит только в митотически активных клетках (исключение составляют лентивирусы). Показано, что для транслокации ретровируса в ядро клетки обязателен разрыв ядернойоболочки. Основываясь на этом, Чан с соавт. в 1998 г. предложили новый метод введения ретровирусного вектора в геном крупного рогатого скота, который заключался в следующем. Ооциты, находящиеся на стадии метафазы II второго деления мейоза и не имеющие ядерной оболочки на этой стадии вплоть до образования пронуклеусов после оплодотворения, инфицировали ретро-вирусным вектором, сконструированным на основе вируса мышиной лейкемии Молони (MoMLTV), упакованного в оболочку, в состав которой входил гликопротеин псевдотипа вируса везикулярного стоматита G. В результате оплодотворения инфицированных ооцитов и их культивирования
ядра, пересаженного из соматической клетки. Одни считают, что такие проблемы методики клонирования будут решаться по мере развития научного прогресса, другие утверждают, что клонирование абсолютно здорового потомства невозможно в принципе и что даже вполне здоровые на первый взгляд клонированные животные могут иметь генетические болезни.
Вымершие виды, которые проще всего клонировать[2]. Несмотря на то, что вымирание видов – процесс естественный, и в живой природе это происходит регулярно, защитники природы весьма жалеют об утрате некоторых из них и не прочь повернуть время вспять. Учёные уже задумываются о возможности клонирования некоторых животных с хорошо сохранившейся цепочкой ДНК. Наиболее вероятными кандидатами являются следующие виды.
1. Это, конечно же, всем знакомый мамонт, размеры которого немногим отличаются от размеров современного слона, а генетического материала предостаточно. Если бы не политическая истерия вокруг клонирования, вполне вероятно, что мы уже могли бы лицезреть первых мамонтов в зоопарке.
2. Почему бы не возродить самую большую птицу в мире – гигантскую моа? Тем более, что её птенцы без проблем может высидеть обыкновенная страусиха. Извлечение ДНК моа из её костей и яиц, найденных в новозеландских пещерах, возможно.
3. Шерстистый носорог, как и мамонт, почти не отличается от своих потомков, и его ДНК находится в отличном состоянии.
4. Сумчатый волк. Последний сумчатый волк (тилацин) из зоопарка Хобарта отправился в мир иной в 1936 году.
5. Саблезубые тигры могли бы снова появиться если не в лесах, то хотя бы в зоопарках… если бы не два препятствия. Во-первых, их останки, сохранившиеся более-менее прилично, лежат в смоляных шахтах Ла-Брея – следовательно, извлечению цепочки ДНК препятствует смола. Во-вторых, получить разрешение и достать мать-донора будет достаточно тяжёлой задачей, ведь тигры сейчас занесены в Красную Книгу.
6. Если бы не запрет на клонирование человека, учёные в первую очередь озаботились бы воссозданием неандертальцев.
Также можно было бы клонировать такие виды как ирландский лось, короткомордый медведь, гигантский ленивец и глиптодон, если бы не их размеры. Основная сложность в их клонировании заключается в нахождении подходящей суррогатной матери – все самки близких видов слишком малы [2].
4. Трансгеноз животныхТермин «трансгеноз» возник в начале 70-х годов, значительно ранее того момента, когда он стал использоваться в современном значении этого слова. Первоначально им обозначали перенос генов в клетки, растущие в культуре, т.е. invitro. В настоящее время этот термин используют применительно к переносу генов в целые организмы (система invivo), а сами такие генетически измененные организмы называют трансгенными.В 1980 г. Гордон с помощью микроинъекций "голой" ДНК в мужской пронуклеус зиготы мыши получил первых животных, содержавших в своем геноме искусственно введенную экзогенную ДНК. Такие животные в дальнейшем и были названы трансгенными, а сам процесс их получения - трансгенозом. Первоначальный вариант трансгеноза, использованный Гордоном, сейчас называют классическим (рис. 5).С развитием техники молекулярного клонирования генов число публикаций по получению и исследованию трансгенных мышей стремительно росло, постепенно расширялся спектр проблем и задач, решаемых с помощью трансгеноза. Одной из самых впечатляющих работ на ранних этапах развития трансгеноза были эксперименты Пальмитера с соавт. (1982) по микроинъекции в зиготы мышей гена гормона роста крысы, находящегося под контролем сильного промотора гена металлотиенина мыши МТ-1мыши. Перенос такого искусственного конструкта привел к ускоренному росту мышей и значительному увеличению веса трансформированных животных, развившихся из прооперированных зигот (рис. 6).Рисунок 5 - Классическая схема трансгеноза[3]Вскоре анализу экспрессии в организме мышей были подвергнуты сотни структурных генов, генов различных вирусов, онкогенов, антионкогенов и др. К середине 80-х годов были начаты эксперименты по созданию трансгенных сельскохозяйственных (с/х) животных. К этому времени были подобраны оптимальные условия для визуализации пронуклеусов зигот с/х животных, поскольку большинство зигот имеет значительное количество пигментных и жировых гранул, затрудняющих процесс микроинъекции.Попытки переноса гена гормона роста быка, овец, человека, гена рилизинг-фактора гормона роста человека (выход гормона роста в кровь находился под контролем эндогенных регуляторов) в дальнейшем были продолжены на зиготах овец, свиней, кроликов и рыбах как в нашей стране, так и за рубежом.
Рисунок 6 - Трансгенная мышь с геном гормона роста быка (слева) и контрольная [3]Трансгеноз открыл новые пути направленного изменения продуктивности разных видов с/х животных (повышение темпов роста, изменение количества и качества молока, шерсти, увеличение плодовитости), получения животных - биореакторов ценных биологически активных препаратов (таких как фактор свертываемости крови, альфа-антитрипсин, гемоглобин и антитела в молоке, крови или моче), создание новых форм и пород животных, приспособленных к биомедицинским исследованиям, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплантации, пород, устойчивых к различным заболеваниям. В частности, с успехом для направленной экспрессии фармакологически ценных белков используются гены, кодирующие основные белки молока - казеины. В России, например, в 1999 г. были получены трансгенные мыши, экспрессирующие в молоко ценный медицинский препарат - гамма-интерферон человека (600 мкг гамма-интерферона на 1 мл молока). Соответствующая генетическая конструкция может быть использована для получения трансгенных коз, в молоке которых будет экспрессироваться лекарственный белок.Вместе с тем с самого начала работ по трансгенозу были выявлены некоторые сложности, связанные с этой технологией. В первую очередь процедура получения трансгенных животных пока еще остается малоэффективной. Трансгенные животные часто менее жизнеспособны, чем природные особи. Имеются проблемы и со стабильностью экспрессии трансгена. Все это, а также ряд других причин, включая настороженное отношение общественности к данной проблеме, и обусловили ту ситуацию, что до сих пор трансгенные животные (в отличие от трансгенных растений) находят пока лишь ограниченное применение в практике.Кроме традиционного (классического) способа введения чужеродной ДНК с помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы, получили развитие новые системы и способы переноса генов в геном животных (рис. 64). Они позволяют повысить эффективность трансгеноза, что особенно важно для дорогостоящих экспериментов в области биотехнологии с/х животных. Показано, например, что эффективность получения с помощью микроинъекций трансгенных коров, по меньшей мере, в 40 раз ниже, чем у мышей.Одним из таких альтернативных подходов является использование
сперматозоидов в качестве векторов для привнесения чужеродной ДНК в яйцеклетку при ее искусственном оплодотворении. Известно, что сперматозоиды ряда видов животных в отсутствие семенной жидкости способны захватывать чужеродную ДНК. Легкость и простота использования этого метода привели к многочисленным попыткам трансформировать таким образом геном мышей, свиней, крупного рогатого скота, овец, рыб, морского ежа, насекомых, птиц, шпорцевой лягушки, моллюсков. Необходимо отметить, однако, что существует опасность непреднамеренного введения экзогенного генетического материала, который может случайно находиться в окружающей среде, при использовании метода внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) в клиниках по искусственному оплодотворению человека. Показано также, что отмывка сперматозоидов человека после инкубации в растворе с ДНК вируса папилломы человека не приводила к полному удалению экзогенной ДНК из клеток. Часть ДНК прочно связывалось со сперматозоидами и интернализовалась вместе с ними.Еще одним подходом, обеспечивающим увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Чтобы избежать опасности неконтролируемого распространения ретровирусов, используют дефектные по репликации вирусные векторы с вирусом-помощником.Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Однако успешная интеграция вирусного генома с хозяйским геномом происходит только в митотически активных клетках (исключение составляют лентивирусы). Показано, что для транслокации ретровируса в ядро клетки обязателен разрыв ядернойоболочки. Основываясь на этом, Чан с соавт. в 1998 г. предложили новый метод введения ретровирусного вектора в геном крупного рогатого скота, который заключался в следующем. Ооциты, находящиеся на стадии метафазы II второго деления мейоза и не имеющие ядерной оболочки на этой стадии вплоть до образования пронуклеусов после оплодотворения, инфицировали ретро-вирусным вектором, сконструированным на основе вируса мышиной лейкемии Молони (MoMLTV), упакованного в оболочку, в состав которой входил гликопротеин псевдотипа вируса везикулярного стоматита G. В результате оплодотворения инфицированных ооцитов и их культивирования