Файл: Клонирование и трансгеноз животных по дисциплине Современные проблемы биологии.doc
Добавлен: 03.12.2023
Просмотров: 115
Скачиваний: 6
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
in vitroчасть из них развилось до стадии бластоцисты. После переноса бластоцист реципиентам 4 эмбриона развились до рождения. И хотя количество животных, полученных таким путем, было ограниченным, все они (100%) оказались трансгенными и экспрессировали трансген.
Сообщалось о рождении трансгенной обезьяны, полученной аналогичным путем. Указанный вектор, содержащий в своем составе ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP)под промотором гена альфа-1-фактора элонгации человека, был инъецирован под блестящую оболочку ооцитов макак резусов. Оплодотворение проводили методом ICSI. Эмбрионы на стадии дробления пересаживали суррогатным самкам. 3 эмбриона развивались до рождения, один из новорожденных оказался трансгенным и экспрессировал трансген в клетках ногтей и волос (Чан, 2001).
В 2002 г. был предложен простой и эффективный метод получения трансгенных мышей, крыс и других животных путем инфицирования оплодотворенных яйцеклеток с помощью рекомбинантного лентивирусного вектора. 10-100 пкл раствора данного вектора, содержащего ген GFP, вводили непосредственно под блестящую оболочку зигот мышей. 80% полученных таким образом потомков оказались трансгенными, почти у всех потомков была обнаружена экспрессия трансгена (Луи и др., 2002).
В результате прогресса в развитии трансгеноза появились возможности для крупномасштабных изменений генома, включая манипуляции с фрагментами или целыми хромосомами. Последняя технология получила название хромосомная инженерия. Ей способствовала разработка подходов к созданию искусственных хромосом млекопитающих, обязательными элементами которых являются центромера, теломеры и oriрепликации. Искусственные хромосомы предоставляют уникальную возможность для изучения взаимосвязи между хромосомными структурами и их функциями. Использование хромосомного трансгеноза позволяет осуществлять перенос очень больших генов и целых кластеров генов со всеми окружающими их природными генетическими элементами. При этом также полностью исключается негативное влияние эффекта положения на трансген. Использование нового подхода на базе эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), получившего название опосредованного микроклетками транспорта хромосом, позволило получать химерных мышей с целыми хромосомами человека или их фрагментами (
трансхромосомные мыши). В частности, были получены мыши, содержащие фрагменты хромосом человека с локусами легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, которые оказались способными синтезировать специфические человеческие антитела.
Молекулярные механизмы трансгеноза. При микроинъекции в пронуклеусы экзогенной ДНК встройка трансгена происходит, как правило, в единичный участок генома в виде тандемов (до 50 и более копий, расположенных чаще всего в ориентации голова-хвост). Единичные фрагменты генов удается встраивать в геном при использовании в качестве вектора ретровирусов.
При этом в большинстве случаев чужеродная ДНК встраивается в произвольные участки генома. Между тем постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о том, что существуют некоторые «предпочтительные» зоны, с которыми интегрирует экзогенная ДНК. Таковыми, по-видимому, являются транскрибирующиеся участки генома, "горячие" точки рекомбинации, области начала репликации, а также разнообразные повторяющиеся последовательности. Последние облегчают встраивание трансгенов за счет механизмов негомологичной рекомбинации.
5. Трансгенные животные и моделирование заболеваний человека
Очень важным направлением использования трансгенных животных является создание моделей различных патологий человека. Это, с одной стороны, позволяет подтвердить роль тех или иных генов в определенном заболевании, а, с другой, создать модель, на которой можно более детально исследовать молекулярные механизмы нарушений и осуществлять целенаправленный подбор лекарственных средств. Использование для этих целей мышей важно с той точки зрения, что у них примерно такой же размер генома и такое же число генов, как у человека. В настоящее время с помощью трансгеноза осуществлено моделирование множества различных заболеваний человека, таких, например, как рак груди, рак простаты, нейрофиброма, эритролейкемия. диабет и др.
На модели трансгенных животных проведены многочисленные исследования по выяснению роли различных онкогенов в злокачественных перерождениях клеток млекопитающих. Благодаря этим экспериментам установлено, в частности, что отдельные онкогены, перенесенные в мышей и крыс, могут определять появление у трансгенных особей опухолей в тех тканях, где они экспрессируются. Так, ген с-тус под контролем регуляторных элементов гена иммуноглобулина (гены иммуноглобулинов экспрессируются тканеспецифично в В-клетках) вызывал у трансгенных мышей лимфомы В- и пре-В-клеток
, а этот же онкоген под контролем LTR вируса MMTV обусловливал возникновение аденокарциномы в молочной железе самок, т.е. в том органе, где экспрессируются гены вируса MMTV.
С использованием трансгенных мышей продемонстрировано онкогенное свойство мутантного гена р53. В кооперации с онкогеном ras мутантный ген р53 вызывал злокачественное перерождение клеток. У 20% трансгенных животных возникали аденокарциномы легких, остеосаркомы и лимфомы. Полученные данные позволили прийти к заключению о том, что нормальный ген р53 является не онкогеном, а антионкогеном, продукт которого инактивируется при наличии мутантного белка р53.
Другим примером моделирования патологий человека может служить болезнь Альцгеймера (БА), которая является наиболее распространенной причиной прогрессирующей деменции в пожилом возрасте. Была показана важная роль в этом мутаций в трех генах: АРР,пресенилинах 1 и 2 (PSEN1 и 2). Первые попытки смоделировать БА у млекопитающих заключались в получении трансгенных мышей, экспрессирующих ген АРР, несущий мутации, приводящие к развитию заболевания у человека.
Такие мыши развивались нормально, но с возрастом накапливали множественные отложения нерастворимого амилоида, а также в ряде случаев демонстрировали отклонения в поведении. Трансгенные мыши, несущие мутант-ный ген АРР, были использованы для разработки нового подхода к терапии БА - Р-амилоидной иммунизации.
Сообщалось о переносе целой экзогенной митохондриальной ДНК (мтДНК) в эмбрионы мышей. Цитопласты (энуклеированные клетки), несущие в мтДНК мутацию, связанную с энергетическим метаболизмом, сливали с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) с инактивированными митохондриями. Затем эти ЭСК использовали для получения химер. В результате химерные мыши и их потомки имели ряд аномалий, сходных с клиническими проявлениями болезни человека, обусловленной аналогичной мутацией в мтДНК (Хирано, 2001).
Эмбриональные стволовые клетки и таргетинг генов. Все вышеперечисленные системы получения трансгенных животных имеют тот недостаток, что вводимая этими способами ДНК интегрируется с реципиентным геномом случайным образом, зачастую в виде множества копий, часто наблюдаются перестройки трансгена, мутации в геноме хозяина вплоть до летальных. Вследствие этого нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трангенных животных до полного ее отсутствия. Однако в последнее десятилетие техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным осуществлять направленное введение ДНК в любую желаемую часть генома или конкретного локуса.
Основой новой технологии послужило создание эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В 1981 г. одновременно в двух лабораториях были получены первые культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы бластоцист мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). Все ЭСК имеют нормальный диплоидный кариотип, обладают активностями щелочной фосфатазы и теломеразы, экспрессируют ряд других маркеров, характерных для недифференцированных клеток. Это состояние поддерживается в определенных условиях культивирования, в частности, при наличии в культуре фидерного слоя эмбриональных фибробластов и/или фактора ингибирования лейкемии LIF. При удалении последних ЭСК начинают дифференцироваться в многоклеточные агрегаты, состоящие из дифференцированных и недифференцированных клеток, называемые эмбриоидными телами. Несколько позднее были получены культуры эмбриональных герминативных клеток (ЭГК), выделенные из первичных половых клеток мыши (Donovan, 1994). Затем были выделены линии клеток, подобные ЭСК, из эмбрионов кролика, хомячка, норки, свиньи, коровы, овцы, обезьян и, наконец, в последние годы такие линии выделены из бластоцист и первичных половых клеток человека.
ЭСК и ЭГК сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длительном культивировании in vitroи, будучи вновь введенными в эмбрион, способны формировать химер, участвуя в развитии тканей всех трех зародышевых листков, включая образование гамет. Однако способность ЭСК к формированию химер и наследованию этих клеток у их потомков твердо установлена пока только для ЭСК мышей.
Уникальная способность ЭСК сохранять длительное время in vitroсвои плюрипотентные свойства открыла широкие возможности для различных манипуляций с их генами. Были разработаны пути и методы направленного введения чужеродной ДНК в ЭСК путем гомологичной рекомбинации с экзогенной ДНК. При трансформации ЭСК in vitroв результате такой рекомбинации происходит вставка эндогенной ДНК в «ген-мишень». Затем, после отбора ЭСК с модифицированным геномом, их инъецируют в полость бластоцисты другой линии мышей или агрегируют с зародышами более ранних стадий развития, после чего их пересаживают в матку приемной матери. Среди потомков отбирают химерных животных, в результате скрещивания которых получают гомозиготных мышей. Генотип гомозигот представлен исключительно модифицированными ЭСК. Общая схема осуществления направленного изменения генов у животных приведена на рис. 7.
Сообщалось о рождении трансгенной обезьяны, полученной аналогичным путем. Указанный вектор, содержащий в своем составе ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP)под промотором гена альфа-1-фактора элонгации человека, был инъецирован под блестящую оболочку ооцитов макак резусов. Оплодотворение проводили методом ICSI. Эмбрионы на стадии дробления пересаживали суррогатным самкам. 3 эмбриона развивались до рождения, один из новорожденных оказался трансгенным и экспрессировал трансген в клетках ногтей и волос (Чан, 2001).
В 2002 г. был предложен простой и эффективный метод получения трансгенных мышей, крыс и других животных путем инфицирования оплодотворенных яйцеклеток с помощью рекомбинантного лентивирусного вектора. 10-100 пкл раствора данного вектора, содержащего ген GFP, вводили непосредственно под блестящую оболочку зигот мышей. 80% полученных таким образом потомков оказались трансгенными, почти у всех потомков была обнаружена экспрессия трансгена (Луи и др., 2002).
В результате прогресса в развитии трансгеноза появились возможности для крупномасштабных изменений генома, включая манипуляции с фрагментами или целыми хромосомами. Последняя технология получила название хромосомная инженерия. Ей способствовала разработка подходов к созданию искусственных хромосом млекопитающих, обязательными элементами которых являются центромера, теломеры и oriрепликации. Искусственные хромосомы предоставляют уникальную возможность для изучения взаимосвязи между хромосомными структурами и их функциями. Использование хромосомного трансгеноза позволяет осуществлять перенос очень больших генов и целых кластеров генов со всеми окружающими их природными генетическими элементами. При этом также полностью исключается негативное влияние эффекта положения на трансген. Использование нового подхода на базе эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), получившего название опосредованного микроклетками транспорта хромосом, позволило получать химерных мышей с целыми хромосомами человека или их фрагментами (
трансхромосомные мыши). В частности, были получены мыши, содержащие фрагменты хромосом человека с локусами легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, которые оказались способными синтезировать специфические человеческие антитела.
Молекулярные механизмы трансгеноза. При микроинъекции в пронуклеусы экзогенной ДНК встройка трансгена происходит, как правило, в единичный участок генома в виде тандемов (до 50 и более копий, расположенных чаще всего в ориентации голова-хвост). Единичные фрагменты генов удается встраивать в геном при использовании в качестве вектора ретровирусов.
При этом в большинстве случаев чужеродная ДНК встраивается в произвольные участки генома. Между тем постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о том, что существуют некоторые «предпочтительные» зоны, с которыми интегрирует экзогенная ДНК. Таковыми, по-видимому, являются транскрибирующиеся участки генома, "горячие" точки рекомбинации, области начала репликации, а также разнообразные повторяющиеся последовательности. Последние облегчают встраивание трансгенов за счет механизмов негомологичной рекомбинации.
5. Трансгенные животные и моделирование заболеваний человека
Очень важным направлением использования трансгенных животных является создание моделей различных патологий человека. Это, с одной стороны, позволяет подтвердить роль тех или иных генов в определенном заболевании, а, с другой, создать модель, на которой можно более детально исследовать молекулярные механизмы нарушений и осуществлять целенаправленный подбор лекарственных средств. Использование для этих целей мышей важно с той точки зрения, что у них примерно такой же размер генома и такое же число генов, как у человека. В настоящее время с помощью трансгеноза осуществлено моделирование множества различных заболеваний человека, таких, например, как рак груди, рак простаты, нейрофиброма, эритролейкемия. диабет и др.
На модели трансгенных животных проведены многочисленные исследования по выяснению роли различных онкогенов в злокачественных перерождениях клеток млекопитающих. Благодаря этим экспериментам установлено, в частности, что отдельные онкогены, перенесенные в мышей и крыс, могут определять появление у трансгенных особей опухолей в тех тканях, где они экспрессируются. Так, ген с-тус под контролем регуляторных элементов гена иммуноглобулина (гены иммуноглобулинов экспрессируются тканеспецифично в В-клетках) вызывал у трансгенных мышей лимфомы В- и пре-В-клеток
, а этот же онкоген под контролем LTR вируса MMTV обусловливал возникновение аденокарциномы в молочной железе самок, т.е. в том органе, где экспрессируются гены вируса MMTV.
С использованием трансгенных мышей продемонстрировано онкогенное свойство мутантного гена р53. В кооперации с онкогеном ras мутантный ген р53 вызывал злокачественное перерождение клеток. У 20% трансгенных животных возникали аденокарциномы легких, остеосаркомы и лимфомы. Полученные данные позволили прийти к заключению о том, что нормальный ген р53 является не онкогеном, а антионкогеном, продукт которого инактивируется при наличии мутантного белка р53.
Другим примером моделирования патологий человека может служить болезнь Альцгеймера (БА), которая является наиболее распространенной причиной прогрессирующей деменции в пожилом возрасте. Была показана важная роль в этом мутаций в трех генах: АРР,пресенилинах 1 и 2 (PSEN1 и 2). Первые попытки смоделировать БА у млекопитающих заключались в получении трансгенных мышей, экспрессирующих ген АРР, несущий мутации, приводящие к развитию заболевания у человека.
Такие мыши развивались нормально, но с возрастом накапливали множественные отложения нерастворимого амилоида, а также в ряде случаев демонстрировали отклонения в поведении. Трансгенные мыши, несущие мутант-ный ген АРР, были использованы для разработки нового подхода к терапии БА - Р-амилоидной иммунизации.
Сообщалось о переносе целой экзогенной митохондриальной ДНК (мтДНК) в эмбрионы мышей. Цитопласты (энуклеированные клетки), несущие в мтДНК мутацию, связанную с энергетическим метаболизмом, сливали с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) с инактивированными митохондриями. Затем эти ЭСК использовали для получения химер. В результате химерные мыши и их потомки имели ряд аномалий, сходных с клиническими проявлениями болезни человека, обусловленной аналогичной мутацией в мтДНК (Хирано, 2001).
Эмбриональные стволовые клетки и таргетинг генов. Все вышеперечисленные системы получения трансгенных животных имеют тот недостаток, что вводимая этими способами ДНК интегрируется с реципиентным геномом случайным образом, зачастую в виде множества копий, часто наблюдаются перестройки трансгена, мутации в геноме хозяина вплоть до летальных. Вследствие этого нередко экспрессия одного и того же трансгена может варьировать в широких пределах у трангенных животных до полного ее отсутствия. Однако в последнее десятилетие техника введения чужеродной ДНК в геном животных усовершенствовалась так, что стало возможным осуществлять направленное введение ДНК в любую желаемую часть генома или конкретного локуса.
Основой новой технологии послужило создание эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В 1981 г. одновременно в двух лабораториях были получены первые культуры клеток, выделенных из внутренней клеточной массы бластоцист мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). Все ЭСК имеют нормальный диплоидный кариотип, обладают активностями щелочной фосфатазы и теломеразы, экспрессируют ряд других маркеров, характерных для недифференцированных клеток. Это состояние поддерживается в определенных условиях культивирования, в частности, при наличии в культуре фидерного слоя эмбриональных фибробластов и/или фактора ингибирования лейкемии LIF. При удалении последних ЭСК начинают дифференцироваться в многоклеточные агрегаты, состоящие из дифференцированных и недифференцированных клеток, называемые эмбриоидными телами. Несколько позднее были получены культуры эмбриональных герминативных клеток (ЭГК), выделенные из первичных половых клеток мыши (Donovan, 1994). Затем были выделены линии клеток, подобные ЭСК, из эмбрионов кролика, хомячка, норки, свиньи, коровы, овцы, обезьян и, наконец, в последние годы такие линии выделены из бластоцист и первичных половых клеток человека.
ЭСК и ЭГК сохраняют высокие плюрипотентные свойства при длительном культивировании in vitroи, будучи вновь введенными в эмбрион, способны формировать химер, участвуя в развитии тканей всех трех зародышевых листков, включая образование гамет. Однако способность ЭСК к формированию химер и наследованию этих клеток у их потомков твердо установлена пока только для ЭСК мышей.
Уникальная способность ЭСК сохранять длительное время in vitroсвои плюрипотентные свойства открыла широкие возможности для различных манипуляций с их генами. Были разработаны пути и методы направленного введения чужеродной ДНК в ЭСК путем гомологичной рекомбинации с экзогенной ДНК. При трансформации ЭСК in vitroв результате такой рекомбинации происходит вставка эндогенной ДНК в «ген-мишень». Затем, после отбора ЭСК с модифицированным геномом, их инъецируют в полость бластоцисты другой линии мышей или агрегируют с зародышами более ранних стадий развития, после чего их пересаживают в матку приемной матери. Среди потомков отбирают химерных животных, в результате скрещивания которых получают гомозиготных мышей. Генотип гомозигот представлен исключительно модифицированными ЭСК. Общая схема осуществления направленного изменения генов у животных приведена на рис. 7.