Файл: Учреждение образования полесский государственный университет в. Т. Чещевик молекулярные основы.pdf

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 11 осуществляется отбор организмов, наиболее приспособленных в силу их наследуемых свойств.
Основные атрибуты онтогенеза:
1. Исходная запрограммированность процессов. Наличие уникальной неизменной генетической программы развития, сформированной вследствие мейоза и оплодотворения.
2. Необратимость онтогенеза. При реализации генетической программы невозможен возврат к предыдущим стадиям.
3. Углубление специализации: по мере развития уменьшается вероятность смены траектории онтогенеза.
4. Адаптивный характер: поливариантность онтогенеза обеспечивает возможность приспособления к различным условиям.
5. Неравномерность темпов: скорость процессов роста и развития изменяется.
6. Целостность и преемственность отдельных этапов. Признаки, появляющиеся на более поздних стадиях, базируются на признаках, проявляющихся на ранних стадиях.
7. Наличие цикличности: существует цикличность старения и омоложения.
8. Наличие критических периодов, связанных с выбором пути в узловых точках (точках бифуркации) или преодолением энергетических порогов.
Онтогенез характеризуется автономизацией и эмбрионизацией.
Автономизация онтогенеза – это процесс повышения независимости онтогенеза от условий внешней среды: экзогенные факторы развития замещаются эндогенными.
Автономизация онтогенеза базируется на системе корреляций и координаций.
Корреляции – это взаимозависимости между частями развивающегося организма, которые обеспечивают его устойчивое развитие.
Типы онтогенетических корреляций:
1. Геномные – обусловливают целостность генотипа. Достигаются с помощью диплоидности, доминирования, плейотропного действия генов и наличия полигенных систем с участием генов-модификаторов.
2. Морфогенетические – обусловлены эмбриональной индукцией и нейрогуморальной регуляцией целостности организма.
3. Эргонтические – фенотипические корреляции, обусловленные взаимозависимостью между функциями органов.
Координации – это согласованные изменения между частями организма с точки зрения филогенеза. Координации обеспечивают формирование

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 12 адаптивных комплексов.
Типы филогенетических координаций:
1. Биологические координации – адаптивный ответ на изменения среды.
Биологические координации устанавливаются через функциональную деятельность организма (например, удлинение тела и редукция конечностей у змей, змееобразных ящериц и амфибий).
2. Динамические координации – координации между взаимосвязанными органами. Например, у млекопитающих хорошо развиты и орган обоняния, и обонятельные доли переднего мозга.
3. Топографические координации – выражаются в закономерных изменениях пространственных соотношений между органами, не связанными непосредственной функциональной зависимостью.
Эмбрионизация онтогенеза – это возникновение в ходе эволюции способности проходить значительную часть зародышевого развития под защитой материнского организма или зародышевых оболочек. У животных эмбрионизация онтогенеза выражается в переходе к яйцекладному и внутриутробному типам онтогенеза, у растений может выражаться в редукции гаметофита, формировании семени с семенной кожурой и запасом питательных веществ в виде эндосперма и/или специализированных семядолей и формировании плода (ароморфоз) и плодоподобных структур (идиоадаптации).
3.
Методы исследования молекулярных механизмов
индивидуального развития организма. Модельные объекты
Классические методы экспериментальной эмбриологии:
1. Методы микрохирургии эмбриона (начало XX века, Г. Шпеман): снятие оболочек яиц животных, пересадка частей одного эмбриона к другому. Данные методы используются для изучения последствий разрушения частей эмбриона или его отдельных клеток в онтогенезе организма и выявления путей миграции клеток и источников развития тканей.
2. Метод эксплантации – иссечение небольшого участка эмбриона и выращивание его на искусственной среде. С помощью этого метода можно получать информацию об источниках развития тканей из данного участка зародыша и выявлять гистогенетические закономерности развития.
3. Метод трансплантации ядер – метод, позволяющий клонировать зародышей.
4. Метод прижизненного наблюдения – метод, позволяющий прослеживать перемещение эмбрионального материала (морфогенетические движения) при

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 13 помощи меток, наносимых на зародыш прижизненными красителями.
Современные методы:
1. Методы переноса генов и их частей: а) метод микроинъекций – генетическую конструкцию вносят в зиготу при помощи микропипетки, закрепленной в держателе микроманипулятора. б) метод электропорации – метод основан на способности клеточной мембраны, становиться проницаемой для экзогенных молекул ДНК под действием импульсов высокого напряжения. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды. в) метод биобаллистической трансформации – на частички вольфрама, платины или золота (размер: 0,1 – 3,5 мкм) напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия эмбрионов на ранней стадии развития помещается под биобаллистическую пушку, в которой вакуумным насосом уменьшается атмосферное давление, что приводит к выбрасыванию частичек металла с огромной скоростью из пушки, которые, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Располагающиеся непосредственно по центру клетки погибают, а по периметру будут находиться трансформированные клетки. Далее эмбрионы переносят на среду для дальнейшего культивирования. г) метод липофекции – данный метод основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток. д) метод трансформации при помощи сперматозоидов – можно разделить трансформацию при помощи сперматозоидов на два типа: естественную и искусственную.
Под естественной трансформацией понимают непосредственную инкубацию чужеродной ДНК со спермиями, в этом случае происходит спонтанное поглощение ДНК сперматозоидами и накопление данной ДНК на поверхности мембран сперматозоидов. При искусственной трансформации применяют различные способы инкорпорирования чужеродной
ДНК в мужские гаметы: липофекция, использование диметилсульфоксида. е) метод трансформации с помощью агробактерий – активно используется для получения генетически модифицированных растений. Также показана возможность использования этого метода при получении трансгенных морских

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 14 беспозвоночных животных, в частности, морских ежей, для которых продемонстрировано содержание ряда генов, которые встречаются только у агробактерий. Процедура трансформаци заключается в добавлении к эмбриональным клеткам морских ежей суспензии агробактерий, которые далее культивируют 1–2 суток и спустя 1–2 недели определяют экспрессию перенесенных генов.
2. Методы «выключения» генов: а) Нокдаун генов – метод, позволяющий снизить экспрессию одного или нескольких генов при помощи изменения соответствующей последовательности нуклеотидов, либо при помощи короткого олигонуклеотида, комплементарного соответствующей молекуле мРНК. В случае, когда изменяется последовательность гена, организм называют нокаутным по данному гену. В случае использования коротких олигонуклеотидов, комплементарных соответствующим мРНК или связывающимися с последовательностью нуклеотидов в ДНК, нокдаун гена приводит к временному изменению параметров экспрессии гена, без внесения изменений в структуру хромосом и последовательности ДНК гена.
Кратковременный нокдаун генов используют в биологии развития, так как олигонуклеотиды легко могут быть введены в зиготу и будут попадать во все дочерние клетки в ходе эмбрионального развития. б) РНК-интерференция (англ. RNA interference, RNAi) — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.
Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.
Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты размером 21–25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса
RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute (Argo) либо ингибирование трансляции и/или деаденилирования мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 15
Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает
RNAi полезным инструментом для исследований с использованием культур клеток и живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызывают супрессию специфических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии и медицины.
3. Методы культивирования эмбриональных клеток и тканей и их маркировка. В настоящее время созданы соответствующие питательные среды и разработаны технологии для длительного поддержания жизнеспособности эмбриональных клеток, в частности, стволовых клеток, в культуре. Применение антител или олигонуклеотидов, конъюгированных с флуоресцентными зондами, позволяет осуществлять прижизненный мониторинг распределения инструкционных молекул мРНК и белков в эмбриональных клетках, а также миграции эмбриональных клеток в развивающемя организме эмбриона.
К основным модельным объектам, используемым в исследовании молекулярно-генетических механизмов онтогенеза, используют эмбрионы низших беспозвоночных животных, насекомых (в частности, Drosophila
melanogaster), амфибий, птиц, лабораторных мышей. Применение таких разнообразных групп организмов в качестве модельных объектов обусловлено значительным сходством основных этапов их онтогенеза.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 16

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 17 промотора, контролируя эффективность и скорость транскрипции с конкретного промотора. Энхансеры активируют только лежащие в цис- положении промоторы (т.е. промоторы, лежащие на одной и той же хромосоме). Энхансеры могут регулировать время экспрессии генов и обуславливают также тканеспецифическую транскрипцию.
Сайленсеры – это последовательности ДНК, которые ослабляют транскрипцию гена. Одна и та же последовательность ДНК может выполнять функции энхансера или сайленсера в зависимости от того, какие регуляторные белки вырабатываются в клетках данного типа.
Инсуляторы (MAR/SAR-последовательности) – это последовательности
ДНК (300–1000 п.н.), которые обеспечивают относительную автономность функций гена и его регуляторных последовательностей.
Трансрегуляторные факторы – это растворимые молекулы белков и РНК, которые продуцируются одним геном и взаимодействуют с другими генами на одной той же или соседних хромосомах. Трансрегуляторные факторы транскрипции позволяют инициировать транскрипцию только в строго определенных ДНК-последовательностях. При отсутствии данных факторов транскрипция инициируется на случайных последовательностях. Данные трансрегуляторные факторы делятся на взаимодействующие с ДНК и с РНК- полимеразой, на общие и специальные. Общие транскрипционные факторы присутствуют практически во всех клетках и поэтому не могут регулировать дифференциальную экспрессию генов. Однако, они могут быть вовлечены во взаимодействие между участком промотора и энхансера таким образом, что будет происходить дифференциальная транскрипция определенных генов в определенных клетках.
Специальные транскрипционные факторы представляют собой группу ядерных белков, характерных для ограниченного набора клеток и способных регулировать транскрипционную экспрессию генов.
Пример, CHF-1 – пептид, обнаруживаемый только в клетках передней доли гипофиза, который присоединяется к 5’- элементу промотора в гене гормона роста человека.
2. ДНК-белковые и белок-белковые взаимодействия.
Гиперчувствительные сайты ДНК
В молекуле ДНК показано наличие гиперчувствительных сайтов к ДНКазе
I. Данные участки гидролизуются очень малыми количествами ДНКазы, что свидетельствует об их чрезвычайной доступности для внешних молекул.
Паттерн гиперчувствительных участков, связанных с генами, активность