Файл: Учреждение образования полесский государственный университет в. Т. Чещевик молекулярные основы.pdf

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 18 которых регулируется в развитии, являются тканеспецифичными.
Гиперчувствительные сайты ДНК обычно располагаются внутри или поблизости от сайтов энхансеров. Большинство гиперчувствительных сайтов
ДНК лишены нуклеосомной структуры. Это дает возможность присоединения к ним трансрегуляторных факторов и, соответственно, регулирует экспрессию генов, локализованных в данных участках ДНК.
Важную роль в дифференциальной экспрессии генов играют белок- белковые взаимодействия. Основными неспецифическими ингибиторами экспрессии генов являются белки гистоны, которые образуют нуклеосомы, внутри которых гены не экспрессируются. В геноме эукариот гены гистонов повторяются в десятки раз чаще, чем структурные гены. Репрессия генома гистонами является главным фактором избирательного включения и выключения генов при онтогенезе. Основное значение в репрессии генома имеет гистон Н1. H1 препятствует взаимодействию транскрипционных факторов с ДНК, ингибирует транскрипцию, осуществляемую РНК- полимеразой 2, ингибирует синтез (репликацию) ДНК. Гистоны способны подвергаться постсинтетическим обратимым модификациям (ацетилирование, фосфорилирование, АДФ-рибозилирование), которые приводят к изменению конформации (формы) белков гистонов и уменьшают степень взаимодействия гистонов с ДНК. Это дает возможность клетке оказывать регулирующее действие на экспрессию генов.
В то же время показано наличие негистоновых белков (например, HMG14,
HMG17), которые связываются с ДНК вблизи нуклеосом, что обеспечивает возможность транскрипции генов без нарушения структуры нуклеосом вследствие их модификации данными белками.
Также белки ядерного матрикса, связываясь с генами, способствуют их активной транскрипции. Причем в разных типах клеток с белками ядерного матрикса связаны разные гены.
3. Доменная структура факторов транскрипции, важных для
раннего развития животных
Негистоновые белки, регулирующие транскрипцию, характеризуются наличием определенного участка полипептидной цепи, ответственного за связывание с участками ДНК, содержащими последовательность ТААТ, и называемого гомеодоменом. Гомеодомен состоит из аминокислот, которые придают молекуле белка специфическую необходимую для связывания с ДНК конформацию. Белки, содержащие гомеодомен, действуют в промоторной

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 19 области целевых генов в комплексе с другими факторами транскрипции, часто также белками, содержащими гомеодомен. Такие комплексы, как правило, имеют намного более высокую специфичность по сравнению с белком, имеющим единственный гомеодомен.
Гомеодомен кодируется последовательностью ДНК – гомеобоксом.
Гомеобокс обнаружен в генах, вовлеченных в регуляцию развития у животных, грибов и растений. Гены, которые содержат гомеобокс, образуют отдельное семейство. В частности выделяют Hox-гены, которые контролируют сегментацию во время развития. Гены, содержащие гомеобокс, кодируют факторы транскрипции, которые, как правило, переключают каскады других генов. Мутации генов, содержащих гомеобокс, могут иметь значительные видимые фенотипические проявления (мутация данных генов у дрозофилы – это появление конечностей вместо антенн и появление второй пары крыльев; дупликации генов, содержащих гомеобокс, может вызывать образование новых сегментов тела).
Выделяют следующие типы гомеодоменов:
1) «спираль-поворот-спираль», в которой три α-спирали соединены короткими неспиральными участками. Две более короткие α-спирали, расположенные ближе к N-концу полипептидной цепи, антипараллельны, а третья α-спираль, более длинная и расположенная ближе к С-концу, примерно перпендикулярна осям двух первых; именно она непосредственно связывается с
ДНК.
2) basic HLH – это последовательность аминокислот, характеризующаяся двумя альфа-спиралями, соединенными петлей. Факторы транскрипции, включающие этот домен, являются димерами, спираль каждого из которых содержит основные аминокислоты, которые облегчают связывание с ДНК. bHLH белки обычно связываются с последовательностью ДНК называемой E- бокс, который представляет собой палиндром CACGTG.
3) «цинковые пальцы» – это активаторы транскрипции, играющие важную роль в развитии и определении пола. Данный гомеодомен содержит до 10 повторяющихся единиц, содержащих по 30 аминокислот и в них входит от 7 до
11 атомов цинка.
4) «лейциновая застежка» – молекула содержит 4-5 остатков лейцина, которые отделены друг от друга 7 другими аминокислотами.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 20
4.
Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов.
Влияние 5-азацитидина на дифференцировку клеток in vitro
Метилирование ДНК меняет структуру гена, тем самым регулируя его активность. В особенности важную роль в регуляции активности гена играет его метилирование в области промотора. В частности, после репликации ДНК около 5 % цитозинов подвергается метилированию ферментативным путем с участием фермента метилтрансферазы. Степень метилирования цитозинов в гене может контролировать его транскрипцию. Распределение метилированных и деметилированных цитозинов устойчиво наследуется на протяжении многих клеточных делений и исчезает в половых клетках. Пример, в развивающихся эритроцитах человека ДНК, участвующая в синтезе глобинов, полностью неметилирована, тогда как те же гены в клетках, которые не синтезируют глобины, метилированы в высокой степени. Клетки печени плода, которые синтезируют гемоглобин на ранних стадиях развития, имеют неметилированные гены для фетального гемоглобина, тогда как у взрослого организма данные гены полностью метилированы. Метилирование ДНК играет также важную роль в поддержании в неактивном состоянии одной из двух Х- хромосом в каждой клетке. Деметилирование ДНК также связано с появлением гиперчувствительных сайтов ДНК.
Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов была показана при использовании 5-азацитидина, который ингибирует метилтрансферазу. При добавлении 5-азацитидина к культуре клеток мышиных фибробластов приводит к трансформации клеток с высокой частотой в миоциты, адипоциты или хондроциты. Полученные фенотипы были стабильны вследствие того, что характер метилирования передается через многие циклы клеточных делений.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 21
ТЕМА 3
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ НА
ПОСТТРАНСКРИПЦИОННОМ И ПРЕТРАНСЛЯЦИОННОМ
УРОВНЕ
1.
Процесс созревания РНК: кэпирование, полиаденилирование,
сплайсинг.
2.
Регуляция транспорта из ядра в цитоплазму. Хранение запасенной
мРНК в цитоплазме (гены «материнского эффекта»).
1. Процесс созревания РНК: кэпирование, полиаденилирование,
сплайсинг
Процессинг РНК является первым этапом посттранскрипционного уровня регуляции активности генов и рассматривается как основной способ дифференциальной экспрессии генов. Процессинг определяет популяцию специфических для клеток мРНК при развитии. Дифференциальный процессинг РНК может приводить к возникновению различных белков в клетках разных типов или в разные периоды в одной клеточной линии.
Регуляция дифференциального процессинга ответственна также за детерминацию полового фенотипа у дрозофилы.
Кэпирование. Кэпирование – первый этап процессинга РНК и происходит котранскрипционно (одновременно с транскрипцией) в ядре, когда синтезируемый транскрипт достигает длины 25–30 нуклеотидов. Кэпирование осуществляется тремя ферментами: РНК-трифосфатазой, гуанилтрансферазой и
7-метилтрансферазой.
Кэп представляет собой один или несколько модифицированных нуклеотидов (7-метилгуанозин) на 5'-конце транскриптов, синтезированных
РНК-полимеразой II. Кроме того, первые два нуклеотида транскрипта могут метилироваться по 2'-O-положению рибозы.
Функции:
1. Регуляция транскрипции. Промоторы многих генов эукариот постоянно содержат полностью собранный инициаторный комплекс, который может синтезировать короткие транскрипты, однако дальнейшее продвижение этого комплекса внутрь гена заингибировано. Такая система позволяет при необходимости быстро начать транскрипцию генов, отвечающих за эмбриональное развитие и ответ клетки на внешние воздействия. Кэпирование

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 22 является переключателем транскрипции с «паузы» на продуктивную элонгацию.
2. Участие в сплайсинге. Кэп-структура стимулирует вырезание интрона, ближайшего к 5'-концу транскрипта.
3. Участие в процессинге 3'-конца мРНК. Кэп стимулирует расщепление 3'- конца мРНК.
4. Регуляция транспорта мРНК между ядром и цитоплазмой.
5. Защита транскрипта от деградации под действием экзонуклеаз. 5'- экзонуклеазы не могут расщеплять трифосфатную связь между кэпом и телом мРНК. Кэп-связывающие белки блокируют доступ нуклеаз к 5'-концу мРНК.
6. Стимуляция трансляции. Большая часть мРНК эукариот транслируется по кэп-зависимому механизму и только относительно небольшая их доля – по механизму внутренней посадки рибосомы. При этом наличие кэпа стимулирует связывание мРНК с рибосомой.
Полиаденилирование. Фермент поли(А)-полимераза присоединяет 3'-концу транскрипта от 100 до 200 остатков адениловой кислоты. Первичный РНК- транскрипт содержит 3’-хвостовую нуклеотидную последовательность, которая продолжается далеко за точку терминации. Внутри этой области имеется сигнальная последовательность ААУААА, необходимая для разрезания РНК на расстоянии 10-30 оснований с 3’-стороны. Мутации в этой последовательности нарушают формирование
3’-конца мРНК.
Отрезание
3’-хвоста и полиаденилирование предшествует сплайсингу. Длина полиА фрагмента определяет продолжительность жизни мРНК и ее трансляции в цитоплазме.
Дифференциальная стабильность мРНК является одним из механизмов дифференцировки и определяет интенсивность синтеза соответствующих белков. Присутствие или отсутствие поли-А регулирует образование белков, которые контролируют пролиферацию клеток. В покоящихся клетках образуются неполные транскрипты, а в растущих клетках синтезируются полные РНК.
Сплайсинг. Реакции сплайсинга катализируются частицами, состоящими из мяРНК в комплексе с 10 белками. Сплайсинг осуществляется только после того, как различные мяРНК войдут в контакт друг с другом и образуют на предшественнике мРНК сплайсосому. Сплайсосома подобно рибосоме участвует в сближении различных РНК друг с другом и образует новые ковалентные связи. Большинство экзонов оканчивается на АГ, а интроны начинаются с пары оснований ГТ. Дифференциальный сплайсинг обуславливает дифференциальную экспрессию генов.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 23
2. Регуляция транспорта из ядра в цитоплазму. Хранение
запасенной мРНК в цитоплазме (гены «материнского эффекта»)
Регуляция активности генов на претрансляционном этапе проявляется во времени задержки выхода мРНК из ядра в цитоплазму, дифференциальной задержке выхода отдельных видов и селекции мРНК, т.е. выходе одних видов мРНК и деградации других в ядре. мРНК выходит из ядра через ядерные поры.
Ядерная оболочка со стороны цитоплазмы находится в контакте с рибосомами.
Рибосомы способны захватывать мРНК, когда она выходит из пор, и далее вытягивать ее из ядер по мере трансляции. При прекращении трансляции на цитоплазматической стороне ядра происходит прекращение транспорта РНК из ядра.
Ооцит контролирует раннее развитие эмбриона благодаря запасенной мРНК. Запасенные материнские мРНК – это мРНК белков гистонов и тубулина, которые важны для образования хроматина и митотического веретена при дроблении; мРНК рибонуклеотидредуктазы (фермент, необходимый для образования дезоксирибонуклеотидов из запасенных рибонуклеотидов); мРНК для актина и других белков.
Запасенные мРНК в цитоплазме ооцита представлены в виде информосом, рибонуклеопротеидных комплексов, где мРНК закрыта специфичными для ооцитов белками от рибосом. При оплодотворении данные РНК высвобождаются и активно включаются в процесс трансляции.
Часть запасенной мРНК распределена неравномерно в ооците. Яйцеклетки морского ежа, лишенные ядра, исходно содержат РНК и могут синтезировать белки со скоростью равной скорости синтеза в нормальных оплодотворенных яйцеклетках. В этой ситуации зародыши могут достигать стадии бластулы. При этом последующая транскрипция в эмбриональных ядрах и развитие активируется материнскими факторами ооцита, которые образуются в результате синтеза запасенных материнских РНК.
Активация запасенных мРНК в информосомах происходит в результате вторичного (цитоплазматического) полиаденилирования с помощью ферментов поли(А)-полимеразы, идентичной той, что задействована в ядерном полиаденилировании, либо цитоплазматической полимеразы GLD-2 при участии
РНК-связывающих белков
(CPSF,CPEB,PUM1).
В ходе цитоплазматического полиаденилирования происходит удлинение поли(А)- хвоста (до 80-150 нуклеотидов) у инактивированных мРНК с укороченным поли(А)-хвостом (около 20 нуклеотидов). В результате цитоплазматического полиаденилирования они активируются и транслируются.

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 24
ТЕМА 4
ИЗБИРАТЕЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК
1.
Межклеточный сигналинг и трансдукция сигналов при взаимодействии
клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом.
2.
Адгезионные молекулы клеточной поверхности и щелевые контакты.
3.
Избирательные взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом и
молекулы субстратной адгезии.
4.
Миграция клеток как результат избирательных взаимодействий.
1. Межклеточный сигналинг и трансдукция сигналов при
взаимодействии клеток друг с другом и с внеклеточным
матриксом
Основой координации биохимических процессов, протекающих в клетках многоклеточных организмов, является межклеточная коммуникация и передача сигнала внутри отдельных клеток.
Пути передачи сигнала организованы как сигнальные каскады, что приводит к амплификации сигнала: количество молекул белков и других веществ, принимающих участие в передаче сигнала, возрастает на каждом последующем этапе по мере удаления от первоначального стимула. В механизме передачи сигнала участвуют первичные посредники, рецепторы, мембранные белки передачи сигнала, вторичные посредники.
Первичные посредники – это внеклеточные химические соединения или физические факторы (квант света), способные активировать механизм передачи сигнала в клетке. В зависимости от функций первичные посредники могут быть разделены на несколько групп:
• гормоны
• цитокины
• нейротрансмиттеры
• факторы роста
• хемокины
Рецепторы – это белки, для которых первичные посредники являются лигандами. Для обеспечения рецепторной функции молекулы белков должны отвечать ряду требований:
1. обладать высокой избирательностью к лиганду;
2. кинетика связывания лиганда должна описываться кривой с

Молекулярные основы онтогенеза
Полесский государственный университет
Страница 25 насыщением, соответствующим состоянию полной занятости всех молекул рецепторов, число которых на мембране ограничено;
3. рецепторы должны обладать тканевой специфичностью, отражающей наличие или отсутствие данных функций в клетках органа- мишени;
4. связывание лиганда и его клеточный (физиологический) эффект должны быть обратимы, параметры сродства должны соответствовать физиологическим концентрациям лиганда.
Клеточные рецепторы делятся на следующие классы:
• мембранные
-рецепторные тирозинкиназы
- рецепторы, сопряжённые с G-белками
- ионные каналы
• цитоплазматические
• ядерные
Мембранные рецепторы распознают крупные (например, инсулин) или гидрофильные (например, адреналин) сигнальные молекулы, которые не могут самостоятельно проникать в клетку.
Цитоплазматические или ядерные рецепторы взаимодействуют с лигандами, способными проникать через мембрану.
Механизмы активации рецепторов. Внешняя сигнальная молекула воздействует на рецепторы клеточной мембраны и активирует их.
Активированные рецепторы передают полученную информацию на систему белковых компонентов мембраны, называемую каскадом передачи сигнала.
Мембранные белки каскада передачи сигнала подразделяют на:
• белки-преобразователи, связанные с рецепторами
• ферменты-усилители, связанные с белками-преобразователями
(активируют вторичные внутриклеточные посредники, переносящие информацию внутрь клетки).
Вторичные посредники. Вторичные посредники – это низкомолекулярные вещества, которые образуются или высвобождаются в результате ферментативной активности одного из компонентов цепи передачи сигнала и способствуют его дальнейшей передаче и амплификации. Вторичные посредники характеризуются следующими свойствами: имеют небольшую молекулярную массу, высокую скорость диффузии в цитоплазме; быстро расщепляются и быстро удаляются из цитоплазмы.
К вторичным посредникам относятся:
• ионы кальция (Ca
2+
);