ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 11.12.2023
Просмотров: 74
Скачиваний: 1
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
39. Опишите технику окрашивания мазков по Граму.
1) на фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтрованной бумаги. Через 1-2мин ее снять, а краситель слить;
2) нанести раствор люголя на 1-2мин;
3) обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60сек до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя;
4) промыть водой;
5) докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный. Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, грациликутные – грамотрицательно.
40. Какие требования предъявляют к искусственным питательным средам?
1) каждая питательная среда должна содержать воду, т.к. все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде;
2) для культивирования гетеротрофных бактерий в питательной среде должен содержаться ограниченный источник углерода и энергии (углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды; часто используют глюкозу и пептон);
3) для синтеза белков, нуклеотида, АТФ, коферментов бактериям требуется источник N,S,P и др. мин вещества, в т.ч. макроэлементы; также для нормального функционирования бактериям требуются ионы Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, которые добавляют в питательные среды в виде солей, чаще всего фосфаты;
4) необходим определенный уровень рН, с этой целью питательные среды чаще всего забуфферивают с помощью фосфатов, а при сильном выделении бактериальных кислот к питательным средам добавляют CaCO2;
5) среда должна обладать определенным осмотическим давлением, т.к. большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, то туда добавляют 0,87% р-р NaCl;
6) питательные среды должны быть стерильными.
41. Какие питательные среды различают в зависимости от состава и цели применения?
По составу различают:
1) Синтетическая питательная среда – состоит из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозах;
2) Полусинтетическая питательная среда – наряду с химически чистыми соединениями включает переработанные нативные компоненты неопределенного состава (например, гидролиз мяса, дрожжевой экстракт);
3) Натуральная питательная среда – представляет собой неизмененные нативные компоненты;
4) Простые среды – пептонная вода, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар;
5) Сложные среды – готовятся на основе простых с помощью введения в них сахарного/сывороточного бульона, кровяного агара.
По целям применения различают:
1) Элективные питательные среды – предназначены для выделения и накопления МО определенного вида/определенной группы из материалов, содержащих разнообразно построенную микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которыми отличаются данные микробы. К ЭПС также относят обогащенные среды – стимулируют рост какого-то определенного МО, подавляя рост других (напр, содержание селенит натрия высококонцентрированного выявляет избирательный рост стафилококка) ;
2) Дифференциально-диагностические среды – служат для изучения ферментативной активности бактерий. Состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет. К разряду дифференциально-диагностических сред относятся и комбинативные питательные среды, сочетающие в себе элективные среды, подавляющие рост сопутствующей флоры, и дифференциальные среды, выявляющие ферментативную активность тестируемого микроба(напр, Плоскирева среда и висмут-сульфитный агар, агар Эндо – используются при выделении патогенных кишечных бактерий).
42. Оценка результатов первичного посева по культуральным признакам.
Это 2 этап идентификации ЧК. Морфология микробных колоний является наиболее информационным культуральным признаком. Колонии различают: по величине (крупные – 4-5мм, средние – 2-4мм, малые – 1-2мм и мельчайшие - <1мм), по форме (круглые, розеткообразные, листовидные, амебовидные, складчатые, ризоидные и т.д.), по цвету – цвет колонии зависит от пигмента (белый, желтый, красный, сине-зеленый, зеленый, сиреневый и пр.), по прозрачности (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные), по консистенции (сухие, сочные, слизистые, пастообразные), по поверхности колонии (гладкая, морщинистая, исчерченная, плоская, выпуклая, вдавленная, блестящая, матовая), по краю колонии (ровный, волнистый, бахромчатый, зазубренный), по структуре колонии (аморфная, зернистая, волокнистая). Многие виды бактерий также в процессе роста на питательной среде выделяют продукты метаболизма, обладающие определенным запахом. В жидких питательных средах могут образовываться пленки и осадок в процессе жизнедеятельности бактерий.
Для оценки результатов первичного посева исследуемого материала, чашки с посевом осматривают и изучают морфологию выросших колоний, затем готовят мазки и окрашивают по Граму и микроскопируют. Материал из изолированной колонии пересеивают в отдельные пробирки со скошенным агаром/другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засеивают штрихом на скошенную поверхность агара.
43. Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред «пестрого ряда».
Классический метод идентификации микробов по биохимическим признакам заключается в посеве ЧК на дифференциально-диагностических средах, содержащих определенные субстраты, с целью оценки способности МО ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследование занимает не менее суток. Применяют: оценку сахаролитической активности бактерий (способность сбраживать углеводы и многоатомные спирты с образованием кислоты и газа или только кислоты) с помощью посева на среду Гисса – короткий и длинный «пестрый» ряд. Короткий «пестрый» ряд включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза). Длинный «пестрый» - наряду с перечисленными вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиоза, рамноза и пр.) и спиртами (глицирин и пр.). Для оценки способности ферментации углеводов в среду добавляют индикатор (реактив Андреды и пр.), позволяющий выявлять образование кислых продуктов расщепления (органических кислот) и поплавок – для обнаружения выделения газа.
ЧК исследуемого МО засеивают петлей в среду пестрого ряда, посевы инкубируют при температуре 37С в течение 18-24ч. Если бактерии ферментируют углероды до образования кислых продуктов, то наблюдается изменение цвета среды, при разложении до кислоты и газообразных продуктов наряду с измененным цветом появляется пузырек газа в поплавке; если используют среду с полужидким агаром, то образование газа регистрируют по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.
44. Определение протеолетических ферментов при идентификации бактерий.
Для определения протеолитической ферментации (разложение белка) проводят посев уколом в столбик 10-20% желатина и пептонную воду. Инкубируют при 20-22С в течение нескольких дней. При наличии ферментации желатин разжижается бактериями. В посевах в пептонную воду определяют продолжительность расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2-3сут при 37С путем постановки реакций на аммиак, индол и сероводород.
Реакция на аммиак: узкую полоску лакмусной бумаги укрепляют над пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой, посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака.
Реакция на индол способом Эсмарха: в пробирку с культурой бактерий добавляют 2-3мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эсмарха в присутствии индола (С8H7N), наблюдается розовое окрашивание. При осторожном наслаивании – розовое кольцо.
Реакция на сероводород: в пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтрованной бумаги, смоченной сульфатом железа. При выделении сероводорода образуется нерастворимый сульфид железа, окрашивающий бумагу в черный цвет.
45. Получение изолированных колоний путем механического разобщения микробов при посеве.
Материал из изолированной колонии каждого типа пересеивают в отдельные пробирки со скошенным агаром/другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии, и засеивают штрихом на скошенную поверхность агара. Для выделения и накопления ЧК выбирают колонии только тех бактерий, которые присутствуют в исследуемом материале.
46. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузным методом.
Данный метод определения чувствительности основан на способности антибактериального препарата диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост МО, посеянных на поверхности агара. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста МО вокруг дисков. Результат учитывается по величине диаметра, измеренной в мм. Важна толщина агара (4мм); диаметр чашки Петри-90мм, если вносится 20мл агара, диаметр чашки Петри 100мм, если вносится 25мл агара, диаметр 150мм, если вносится 60мл. Чашку следует располагать на строго горизонтальной поверхности. После заполнения чашки, отстаивают при комнатной температуре для застывания. Перед инкубацией необходимо отследить отсутствие конденсата. Для определения чувствительности стоит использовать только стандартные качественные диски.
Для инокуляции приготовленных чашек с агаром используют 2 способа:
1) использование стерильных влажных тампонов;
2) инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри.
После окончательной инкубации чашку помещают кверху дном на темную матовую поверхность, чтобы свет падал под <45°. Для определения зон задержки роста пользуются штангоциркулем, оббращают внимание только на зону полного подавления видимого роста.
47.Микробное число воды, как его определяют?
Микробное число воды – количество микроорганизмов в 1 мл. Для его определения берут пробу: из крана набирают 500мл в стерильные колбы с ватной пробкой, кран предварительно стерилизуют горящим спиртовым тампоном, затем в течение 10мин спускают воду и только потом берут пробы. Воду из водоемов берут с глубины 10-15 см. Пробы исследуют не позднее 2ч с момента взятия. Если невозможно, то хранят не более 6ч при температуре +1, +5С в холодильнике. Водопроводную воду засеивают в объеме 1мл, из открытых водоемов – 1, 0,1, 0,01мл. Пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10-12мл расплавленного агара, перемешивая тщательно с водой. Посевы инкубируют в течение 1-2сут при температуре 37С. Воду из водоема засеивают одновременно в 2е чашки Петри, одна из которых инкубируется при температуре 37С сут, а другая при температуре 20С – 2е сут.
48. Опишите сущность реакции агглютинации.
Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфическое антигену антитело, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание