Файл: Генная терапия история развития генотерапии.pptx

ГЕННАЯ

ТЕРАПИЯ

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНОТЕРАПИИ

Начало ХХ века – возникновение учения негативной евгеники;
20-е годы ХХ века – обнаружена зависимость степени проявления действия гена от влияния внешней среды или генотипа; Н.К. Кольцов разрабатвает новое направление – евфеника;
1934 г. – С.Н. Давиденков выявил гетерогенность наследственных заболеваний, т.е. одно и то же фенотипическое проявление болезни может быть обусловлено мутациями в разных генах или разными мутациями внутри одного гена;
Годы после Второй мировой войны – дальнейшее развитие генетики, молекулярной биологии;
1980 г. – генетические опыты со стволовыми клетками крови на лабораторных животных;
1989 г. – первые опыты по генной терапии рака;
1995 г. – первый случай излечения наследственной болезни (недостаточность аденозиндезаминазы) методами генной терапии

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

обусловлены нарушениями в процессах хранения, передачи и реализации генетической информации

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ

ГЕННЫЕ

ХРОМОСОМНЫЕ

ХРОМОСОМНЫЕ

ПЕРЕСТРОЙКИ

ИЗМЕНЕНИЕ

ЧИСЛА

ХРОМОСОМ

МОНОСОМИЯ

ТРИСОМИЯ

МОНОГЕННЫЕ

ПОЛИГЕННЫЕ

МУЛЬТИ

ФАКТОРИАЛЬ -

НЫЕ

А -ДОМИНИРУЮЩИЕ

А - РЕЦЕССИВНЫЕ

Х - СЦЕПЛЕННЫЕ

У - СЦЕПЛЕННЫЕ

ТИПЫ НАСЛЕДОВАНИЯ

Болезнь в каждом поколении
Оба пола поражаются одинаково
Болезнь у гомозигот протекает тяжелее, чем у гетерозигот
Вероятность рождения больного ребенка, если болен один из родителей, равна 50%

Болезнь Хантингтона, полидактилия, витилиго, рак молочной железы I типа


аутосомно-доминантное

аутосомно-рецессивное наследование

Больной ребенок рождается у клинически здоровых родителей

---

Болеют братья и сестры
Оба пола поражаются одинаково
Если больны оба супруга, то все дети будут больными

Болезни обмена веществ – муковисцидоз, фенилкетонурия, гемохроматоз и др.


Х-сцепленное наследование

Болеют только мальчики по линии матери (зависит от наследования)
Больной мужчина не передает заболевание, но все его дочери являются носительницами
В браке женщины-носительницы с больным мужчиной 50% дочерей и 50% сыновей больны

Гемофилия, дальтонизм, недостаточность Г-6-ФД, мукополисахаридоз II типа

ПОНЯТИЕ ГЕНА

ГЕН - это ограниченный участок геномной ДНК (или РНК для некоторых вирусов), отвечающий за определенную и специфическую функцию

ГЕН - наследуемая часть генома, оказывающая влияние на какой-либо фенотипический признак

ГЕНЫ

Регуляторные

Белок-кодирующие

РНК-кодирующие

Структурные гены

СТРОЕНИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК

Формирование двойной спирали происходит за счет водородных связей расположенных друг против друга оснований.

Аденин взаимодействует с тимином образуя "слабую связь" (две водородных связи), а гуанин с цитозином образуя "сильную связь" (три водородных связи).

СХЕМА ГЕНА ЭУКАРИОТ

ЛЕЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Симптоматическое лечение проявлений болезни (диета при фенилкетонурии)
Замещающая терапия (введение белка свертываемости крови при гемофилии)
Трансплантация органов и тканей
Хирургическое вмешательство
И др.


МНОГОКРАТНОЕ ДОРОГОЕ

СИМПТОМАТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ

МАЛООЭФФЕКТИВНО!

КОНЦЕПЦИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Причины генетических заболеваний:

мутация в зародышевой линии клеток, которая передается по наследству при наследственных заболеваниях, соматическая мутация, которая вызывает, например, рак, появления в клетке чужеродного генетического материала, например, в результате вирусной инфекции.

---

Способ борьбы с генетическими изменениями:

искусственное введение в пострадавшую клетку новой генетической информации, призванной поправить ту, с которой связана болезнь

Наиболее радикальный способ борьбы с разного рода заболеваниями, вызываемыми изменениями генетического содержания клеток - исправление или уничтожение самой генетической причины заболевания, а не ее следствий

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ: подходы

фетальная генотерапия:
чужеродную ДНК вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введенный материал попадет во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению) соматическая генотерапия:

генетический материал вводят только в соматические клетки и он не передается половым клеткам.

Технология in vivo – локальное введение генетической информации
Технология ex vivo – трансплантация собственных клеток организма:


МЕТОДЫ ДОСТАВКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ

ВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ
Аденовирусные векторы	Ретровирусные векторы	Герпесвирусные векторы

Основные методы доставки новых генов:

Биологические (на основе векторных систем)
Химические
Физические (безвекторный перенос).

ФИЗИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
Баллистическая трансфекция комплексом ДНК-вольфрам/золото	Электротрансфекция ДНК

НЕВИРУСНЫЕ СИСТЕМЫ
ДНК-белок	ДНК в составе липосом	Чистая ДНК	ДНК в плазмиде

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

ПЛЮСЫ

эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов

МИНУСЫ

вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев


Аденовирусные векторы

Ретровирусные векторы

ПЛЮСЫ

эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений

---

МИНУСЫ
встраиваются только в делящиеся клетки могут вызывать инсерционные мутации дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев


ГЕНОМ РЕТРОВИРУСОВ

Компоненты начала сборки вируса

ψ

ψ

«ПАКУЮЩИЕ ЛИНИИ»

Выделение терапевтического гена в контексте регуляторных последовательностей с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Выбор или создание векторной ДНК, удовлетворяющей поставленной цели.
Выделение или искусственный синтез регуляторных элементов.
Лигирование фрагментов ДНК (ДНК вектора, гена, регуляторных элементов, маркерных участков) в нужной последовательности и ориентации.
Клонирование конструкции в оптимальных клетках и отбор рекомбинантных клонов.
Проверка эффективности экспрессии гена и свойств его продукта.

НЕДОСТАТКИ ВИРУСНЫХ СИСТЕМ

Малое количество псевдовирусных частиц
Прониквение ретровируса в клетку носит строго рецепторное взаимодействие
Зависимость экспрессии генов от положения в клетке

ЛИПОСОМЫ

Комплексы липосома-ДНК положительно заряжены
Облегченное проникновение через билипидный слой

Но!

В частицах не содержится информации,

направляющей их прямиком в ядро

ПУТИ РЕШЕНИЯ:

Коньюгация липосом с антителами или лигандами (например, с трансферрином)
Коньюгация липосом с вирусными частицами (например, вирус Сендай)
Создание «суперлипосом» (комплекс липосома-антитела-вирус)
Создание вирусом (вирусные частицы, содержащие векторные молекулы нуклеиновых кислот, целиком заключенные в липосомы разнообразной структуры )

ПРЯМОЕ ВВЕДЕНИЕ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ: БАЛЛИСТИЧЕСКАЯ ТРАНСФЕКЦИЯ

А - дробовое ружье: 1 - пороховой заряд, 2 - войлочный пыж, 3 - дробь;

Б - пороховой ускоритель Клейна и Стэнфорда: 1 - пороховой заряд, 2 - макроноситель (аналог пыжа), 3 - микрочастицы вольфрама, несущие вводимую ДНК, 4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц:

В - ускоритель Колесникова: 1 - заряд гремучей ртути, 2 - макроноситель, 3 - смесь микрочастиц золота и вольфрама, покрытых вводимой ДНК,

---

4 - стопорная диафрагма для остановки микрочастиц, 5, 6 - сетчатые диафрагмы для удаления частей разрушенного макроносителя и дезинтеграции конгломерата микрочастиц соответственно

КЛЕТКИ - СРЕДСТВА ДОСТАВКИ

Гематопоэтические стволовые клетки – клетки-предшественники зрелых клеток крови;
Гепатоциты - дифференцированные и неделящиеся (в обычных условиях) клетки печени;
Астроциты – первичные клетки нервной системы;
Фибробласты – первичные клетки кожи;
Фетальные стволовые клетки

ТРИ СТРАТЕГИИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Коррекция дефекта клетки генными

модификациями этой же клетки путем

1.Восстановление функции «больного» гена

2.Подавление функции «больного» гена

Модификация гена с целью усиления иммунного ответа организма путем

3. Повышения иммунного ответа (иммунизация антигенов или аутологических клеток)

1-я стратегия – ВОССТАНОВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНА

Таргетинг - встраивание генотерапевтической конструкции в определенное место генома
Пополняющая генная терапия - введение здоровых генов при условии сохранения в клетке больного гена
Использование одноцепочечных олигонуклеотидов – создание дополнительных водородных связей обуславливает способность ингибировать транскрипцию за счет перекрывания сайтов связывания транскрипционных факторов

2 стратегия – ПОДАВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ГЕНА

Антисмысловая РНК - получаемый искусственно или природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах

РИБОЗИМЫ

содержат внутри себя антисмысловые участки и участки, осуществляющие ферментативную реакцию

АПТАМЕРЫ

небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений

3-я стратегия – ИММУНИЗАЦИЯ

Генная терапия опухолей. Потенциальные стратегии борьбы с раком:

---