Файл: Morfo.pdf

5.В тканях, пораженных вирусами, нередко формируются вирусные скопления. Эти скопления вирусных частиц называютвирусными тельцами или вирусными включениями. Они окрашиваются специальными методами и изучаются с помощью светового микроскопа. Образование внутриклеточных включений отмечено при многих вирусных инфекциях. Чаще они обнаруживаются только в определенной ткани, но при некоторых заболеваниях встречаются в разнообразных тканях. Они могут находиться в цитоплазме клетки(вирус оспы), в ядре (вирус герпеса) или в ядре и в цитоплазме(вирус кори). Включения имеют разную величину (от 0,25 до 20-30 нм) и форму (круглая, овальная, грушевидная, веретенообразная, неправильная).

6.Строение включений и их расположение в клетках всегда характерно для определенного возбудителя вирусной инфекции, поэтому их обнаружение используется с диагностической целью. Например, при бешенстве в цитоплазме нервных клеток (преимущественно в ткани аммонова рога) обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Они полиморфны (чаще всего имеют круглую форму),

водной клетке обнаруживаются одно или несколько телец разнообразной формы. При натуральной оспе в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживаются тельца Гварниери овальной, грушевидной, веретеновидной или серповидной формы. Вирусные включения обнаружены и при ряде других вирусных заболеваний.

7.Для выявления внутриклеточных включений пользуются специальными методами обработки мазков или срезов из тканей. Включения можно получить в эксперименте при заражении вирусами экспериментальных животных. Их можно выявить и в культуре тканей при искусственном выращивании вирусов.

8.Вопрос о природе внутриклеточных включений окончательно не изучен. В большинстве случаев включения содержат значительное скопление вирусных частиц, выявляемых под электронным микроскопом, что позволяет рассматривать включения как колонии вируса. Путем триптического переваривания или другими способами включения удается раздробить наэлементарные тельца и последними вызвать заболевания в эксперименте с образованием в тканях типичных включений. В отношении телец Бабеша-Негри при бешенстве считают, что эти тельца – результат выпадения ядерных коллоидов.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МОРФОЛОГИЮ И СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ.

Для этого надо знать:

1.Бактериофаги ("пожиратели бактерий") – это вирусы, паразитирующие

вбактериальных клетках. Их размер колеблется в пределах от 20 до 200 нм, т.е.

втех же пределах, что и размеры вирусов. Как и вирусы, бактериофаги проходят через бактериальные мелкопористые фильтры(т.е. являются фильтрующимися агентами) и способны размножаться только в живых молодых бактериальных клетках.

35

2. Бактериофаги широко распространены в природе и находя повсеместно там, где встречаются бактерии. Они могут быть выделены из воды, почвы, молока; их можно обнаружить в организме людей и животных. При кишечных заболеваниях бактериофаг можно выделить из испражнений больных; при других инфекциях он выделяется из соответствующего материала(из гноя, мокроты и т.д.). Особенно легко он выделяется в период выздоровления.

Кроме бактериофагов обнаружены вирусы грибов, актиномицетов; они получили общее название – фаги.

3. С помощью электронного микроскопа показано, что большинство бактериофагов имеют форму головастика или сперматозоида от20 до 800 нм. Они состоят из головки (65-100 нм) и хвостового отростка (100-200 нм). Отросток представляет собой стержень, одетый чехлом, способный сокращаться, и заканчивается шестиугольной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят фибриллы, определяющие специфичность адсорбции фага на бактериальной клетке. Внутри головки находится двунитчатая ДНК, упакованная в виде спирали. Капсид, окружающий ДНК и хвостовой отросток, состоит из белковых субъединиц, уложенных по кубическому или спиральному типу. Белки отростка отличаются от белков головки. Кроме структурных белков в отростке фага имеются ферментные белки – лизоцим и АТФаза, участвующие во взаимодействии с клеткой (растворении стенки клетки-хозяина и сокращении чехла). В головке имеются внутренние геномные белки (в их состав входят полиамины – спермин и путресцин), участвующие в стабилизации структуры ДНК.

Некоторые фаги вместо ДНК содержат РНК; у некоторых – чехол не сокращается. Имеются фаги с короткими отростками(округлой, кубической, палочковидной или нитевидной формы) и без них.

5.Фаги обладают хорошо выраженными антигенными свойствами, в организме на них образуются антитела, нейтрализующие литическую активность фага. Действие антифаговых сывороток строго специфично, следовательно, фаги отличаются друг от друга по антигенным свойствам. У фагов обнаруживаются групповые антигены(общие для родственных фагов) и типоспецифические антигены (строго специфичные). По антигенным свойствам некоторые фаги делятся на серологические группы (например, стафилококковый фаг имеет 6 серогрупп).

6.Бактериофаги более устойчивы к действию физических и химических

факторов, чем бактерии. Хорошо переносят замораживание (-185° С), высушивание, нагревание до +70° С, длительно хранятся при низких температурах, в запаянных пробирках сохраняются годами, а при доступе воздуха разрушаются через 6-8 недель. В спирту, эфире, хлороформе фаг заметно не меняется; 0,5 % раствор сулемы и 1 % раствор фенола не оказывают на него влияния. 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут; губительно действует глицерин в больших концентрациях, УФ-лучи, ионизирующее облучение. Бактериофаги обладают большой чувствительностью к кислотам. Это следует учитывать при энтеральном назначении фага с лечебной или профилактической целями (для нейтрализации HCl желудка назначается сода).

Фаги обладают способностью приспосабливаться к условиям окружаю-

36

щей среды (температура и .)др и адаптироваться к другим вида бактерий, изменяя свою специфичность. Например, брюшнотифозный фаг последовательными пересевами на дизентерийной культуре можно сделать активным в отношении последних. Можно получить фаг, устойчивый к высоким концентрациям глицерина. Известны варианты фагов устойчивые к действию антифаговых сывороток.

Задача 5. ОПИСАТЬ ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГОВ С КЛЕТКОЙ.

Для этого надо знать:

1.Бактериофагия – это процесс взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и в переводе означает "пожирание бактерий". Крайнее выражение процесса бактериофагии – лизис бактерий. Явление бактериофагии впервые заметил Н.Ф. Гамалея в 1898 г., наблюдая просветление свежей культуры сибиреязвенной палочки на жидкой среде. Просветление он объяснил лизисом сибиреязвенных бацилл, а действующий фактор назвал бактериолизином.

2.Широкое и систематическое изучение этого явления было проведено

Ф. д¢Эррелем, выделившим в 1917 г. литический агент из испражнений больных дизентерией и назвавшим этот агент бактериофагом. Он установил, что капля фильтрата из испражнений выздоравливающего человека, внесенная в пробирку с культурой дизентерийных палочек, вызывала постепенное растворение бактерий (просветление жидкости с культурой). Капля отфильтрованной просветленной жидкости обладала способностью растворять свежую взвесь дизентерийных палочек. Полученная жидкость в ничтожном количестве просветляла новую взвесь и т..д Таким образом, при многократном пассировании через культуру дизентерийных палочек действие литического агента не ослабевало, а значительно усиливалось (феномен Ф. д¢Эрреля), поэтому д¢Эррель сделал заключение, что литический агент – это живой агент, ультрамикроскопический паразит бактерий.

Действие бактериофага наблюдалось и на твердых питательных средах. При смешивании литического агента с бактериями на фоне сплошного бактериального роста на агаровой среде можно было увидеть стерильные пятна круглой или неправильной формы. Эти стерильные участки возникали на месте лизиса бактерий и были названы д¢Эррелем "негативными колониями" бактериофага.

Т.к. выделение бактериофага Ф. д¢Эррелем совпало с периодом выздоровления, он рекомендовал бактериофаг для лечения инфекционных заболеваний. В 1927-1928 гг. он применил фаг во время эпидемии холеры в Индии: для уничтожения вибрионов вливал в колодцы по30-40 мл бактериофага. Среди населения, пользовавшегося водой из этих колодцев, смертность снизилась с 62

%до 8%.

3.Размножаются бактериофаги только в живых бактериальных клетках. В основном, стадии взаимодействия фага с клеткой такие же, как и у вирусов: адсорбция, проникновение в клетку, синтез НК и белков, морфогенез, выход из клетки. Но имеются особенности. Фаги обладают еще более строгой специфич-

37

ностью взаимодействия. Определенный фаг взаимодействует определенным видом или подвидом бактерий(это послужило основанием для их наименования по видовым или родовым названиям чувствительных к ним бактерий: стафилофаги, дизентерийные фаги Флекснера). На бактерии адсорбируется много фагов, но для лизиса клетки достаточно одного вириона. Интересен процесс проникновения фагов с хвостовыми отростками в клетку. Эти фаги адсорбируются при помощи фибрилл, после чего активируется АТФаза, и сокращается чехол, в результате наблюдается внедрение стержня в клетку(в этом участвует также фермент лизоцим). ДНК проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Капсид и отросток остаются вне клетки. Уже через 5 минут начинается синтез НК, а затем и белков, а через 30-40 минут микробная клетка лизируется, и в окружающую среду поступает около 200 новых фаговых частиц.

4.Различают: а) поливалентные фаги – взаимодействуют с родственными видами бактерий; б) моновалентные – взаимодействуют с одним определенным видом; в) типовые фаги – взаимодействуют с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

5.Фаги делятся на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги проникают в клетку, размножаются в ней и вызывают ее лизис. Умеренные фаги проникают в клетку, встраиваются в хромосому бактерии и реплицируются вместе

сгенами бактерии (т.е. передаются по наследству), не вызывая лизиса. Встроенный в хромосому бактерии фаг называется профагом. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются лизогенными, а само явление – лизогения. Лизогенные культуры не отличаются от исходных по основным свойствам, но имеют: а) иммунитет к последующему заражению этим же фагом; б) дополнительные свойства (образование токсинов, измененные антигенные свойства), обусловленные генами фага. Изменение свойств бактерий под влиянием профага называется фаговой конверсией. Под влиянием УФ лучей и химических веществ профаг может превращаться в полноценную фаговую частицу, т.е. в вирулентный фаг. Это явление называется индукцией фага.

Если умеренный фаг переходит в вирулентную форму, он может захватить часть хромосомы бактерий и при лизисе перенести эту часть в другую бактериальную клетку. Если эта клетка станет лизогенной, то она приобретет новые свойства. Таким образом, умеренные фаги – мощный фактор изменчивости микроорганизмов.

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству: культуры микроорганизмов, используемые для производства вакцин, антибиотиков, могут стать лизогенными, и в результате появляется опасность, что профаг превратится в вирулентную форму(индукция фага) и лизирует весь штамм.

Задача 6. ОПИСАТЬ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИОФА-

ГОВ.

Для этого надо знать:

1. Бактериофаги очень широко распространены в природе, они обнару38

желтого цвета). Фаги также выпускают в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей и свечей (готовят из фильтратов).

3.На препаратах бактериофага обязательно указывается титр фага или количество фаговых частиц в единице объема или 1в мг (или в 1 таблетке) препарата.

Количество фаговых частиц можно определить путем посева на чувствительную бактериальную культуру, растущую сплошным газоном на плотной питательной среде. В результате размножения фага, вызывающего лизис бактерий, образуются "стерильные пятна" ("бляшки") – негативные колонии фага (они имеют характерную для данного фага форму). Число колоний равно числу фаговых частиц, т.к. один фаг инфицирует одну бактериальную клетку, а стерильное пятно образуется уже в результате его репродукции.

4.Титр фага – наибольшее разведение фага, которое способно еще вызывать лизис чувствительных к нему бактерий.

Титрование – установление титра – можно осуществить на жидких и плотных питательных средах. Для этого препарат бактериофага разводят от 10-1 до 10-9 и более. К каждому разведению добавляют одинаковое количество суточной бульонной культуры соответствующих бактерий. Титр определяется после выдерживания в термостате по просветлению бульона в последней пробирке. Например, если первые шесть пробирок остались прозрачными, а в после-

дующих разведениях и в контрольной пробирке имеется рост культуры, то титр фага 10-6. При титровании на плотных средах разведения фага наносят на засеянную сплошным газоном бактериальную культуру. Титр определяется по последней чашке, где еще имеются "стерильные пятна". В медицинской практике

39