Файл: 696.pdf

Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Скорость размножения растительных клеток невелика – время удвоения их числа равно 1-3 суткам, тогда как время удвоения бактерий или дрожжей обычно 20-30 мин. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности (алкалоиды кодеин, хинин, атропин, винкристин, сердечный гликозид дигоксин, стероид диосгенин и другие). В настоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств, синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный – источник диосгенина, диоскорея дельтовидная – стероидные гликозиды, равольфия змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д.

Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

44

Для того чтобы извлечь из потенциала микроорганизмов все наиболее ценное, используют методы воздействия на геном, существенно расширяющие их производственные возможности – селекцию и мутагенез, а также генетическую инженерию.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ

Традиционно для получения более активных биологических агентов – продуцентов - применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов.

Для изменения природных способностей микроорганизмов используют изменения генотипа - мутации, приводящие к усилению природных способностей микроорганизмов синтезировать и продуцировать нужные вещества, а также синтезировать вещество в избытке – сверх своих потребностей и продуцировать его. Мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих основных изменениях метаболизма клеток:

1)повышение скорости поглощения и утилизации субстрата;

49

4. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

При создании промышленных штаммовпродуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах, возможны разные подходы. Классический подход заключается в выделении нужного микроорганизма из природной среды. Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента отбирают образцы материала и производят посев в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые накопительные культуры. Следующим этапом является выделение чистой культуры, то есть содержащей микроорганизмы одного вида, с дальнейшим дифференциально-диагностическим изучением изолированного микроорганизма и определением его способности продуцировать нужный продукт. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов. Это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта является способность синтезировать целевой продукт и, главное, - уровень продукции. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые являются очень важными. Микроорганизмы должны: обладать высокой скоростью роста; утилизировать необходимые для их жизнедеятельности доступные субстраты; быть резистентными к посторонней микрофлоре. Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Однако такие продуценты («дикие» штаммы), как правило, не обладают способностью к сверхпродукции, которая делает производство прибыльным.

48

1.Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

-традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

-культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации).

2.Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3.Получение безвирусных растений.

4.Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

5.Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

3.4.4. Животные

То, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства их in vitro, стало понятно в начале XX века, когда смогли получить и поддерживать первые клеточные культуры.

Изначально культуры клеток животных применяли для выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Есть вирусы, которые можно размножать в эмбрионах куриного яйца, но их спектр очень невелик. Совершенствование методик культивирования клеток животных позволило использовать их для накопления больших количеств вирусного материала с целью производства из него вакцин. Сейчас же стало возможным

45

вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию, а также подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получают из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости одинаковы. Первое – дает возможность получения трансгенных клеток, тканей или организмов, второе – незаменимо для получения моноклональных антител.

Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток (Табл.5).

Таблица 5 Получение биотехнологических продуктов в культуре

животных клеток

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов

46

и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.

В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты.

Основные этапы гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов – гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10–30 мг/мл моноклональных антител.

Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение. Таким образом, клеточная инженерия является эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.

47