Файл: 696.pdf

3.4. ЭУКАРИОТЫ

Эукарио́ты, или Я́дерные(лат. Eucaryota от греч. εύ- - хорошо и κάρυον - ядро) - надцарство живых организмов, клетки которых содержат ядра (см. Рис.2). Все организмы, кроме вирусов и бактерий, являются ядерными. В ядре содержится генетическая информация (ДНК) и осуществляются процессы репликации (удвоение молекул ДНК), транскрипции (синтез молекул РНК на матрице ДНК) и процессинг РНК с образованием мРНК (см. раздел

34

Первая прописная буква в обозначении рестриктазы соответствует первой букве названия рода, а последующие две или три строчные буквы берутся из первых букв названия вида этого микроорганизма. Далее может приводиться название штамма и, наконец, римская цифра обозначает порядковый номер фермента, отражающий хронологию его выделения из данного организма. Несколько рестриктаз и их сайты узнавания представлены в таблице 6.

Таблица 6. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими

последовательности.

Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНКлигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при

59

Рис. 16. а) схема действия фермента рестриктазы SmaI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с тупыми концами после разрезания ферментом SmaI.

Рис. 17. а) схема действия фермента рестриктазы EcoRI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoRI.

Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.

Номенклатура рестриктаз базируется на названии микроорганизма, из которого она была впервые выделена.

58

4.2.1). В специальном образовании внутри ядра – ядрышкепроисходит синтез рибосомальной РНК (рРНК).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты (простейшие) - все являются эукариотическими организмами. Они аэробны, могут быть одноклеточными и многоклеточными, но все имеют общее строение клеток. В отличие от клеток бактерий у эукариотов в клетках присутствуют органеллы, отделенные от цитоплазмы одной или двумя мембранами. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. Одна мембрана ограничивает эндоплазматический ретикулум (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы. Такое выраженное подразделение цитоплазмы на множество обособленных пространств называется компартментализацией. Ряд клеточных органелл (рибосомы, центриоли) не окружены мембранами.

Митохондрии – важнейшие органеллы, в которых осуществляется окисление органических веществ до диоксида углерода и воды и аккумулирование выделяющейся энергии в виде АТФ. У растений также присутствуют пластиды, например хлоропласты - пластиды зелёного цвета, содержащие хлорофилл. В хлоропластах происходит фотосинтез.

Эндоплазматический ретикулум образует в цитоплазме каналы, по которым осуществляется транспорт веществ. ЭР, примыкающий к ядру, покрыт рибосомами, белковонуклеиновыми комплексами, в которых осуществляется синтез мембранных белков, и называется шероховатым. ЭР без рибосом называют гладким.

Лизосомы – контейнеры с гидролитическими ферментами, пероксисомы – контейнеры с ферментом каталазой, разрушающей пероксид водорода.

35

Рис.13. Строение типичной клетки животного. Отмеченные органеллы: 1. Ядрышко 2. Ядро 3. Рибосома 4. Везикула 5. Шероховатый эндоплазматический ретикулум 6. Аппарат Гольджи 7. Клеточная стенка 8. Гладкий эндоплазматический ретикулум 9. Митохондрия 10. Вакуоль 11. Гиалоплазма 12. Лизосома 13. Центросома (Центриоль)

Аппарат Гольджи – органеллы в виде стопки сплющенных цистерн, от которых отделяются пузырьки и перемещаются к внешней мембране и сливаются с ней (экзоцитоз). Аппарат Гольджи (комплекс Гольджи) — мембранная структура эукариотической клетки, органелла, в основном предназначенная для выведения веществ, синтезированных в эндоплазматическом ретикулуме. Аппарат Гольджи был назван так в честь итальянского учёного Камилло Гольджи, впервые обнаружившего его в

1898 году.

В цитоплазме эукариот содержится цитоскелет – система длинных полых структур, придающий клеткам форму, служит местом прикрепления органелл.

Сравнение про- и эукариотов представлено в Табл.3.

36

мРНК определяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Функцию узнавания кодона осуществляет не сама аминокислота, а молекула транспортной РНК (тРНК), к которой она присоединена и которая содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную кодону – антикодон.

2. Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК.

Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или

рестриктазами.

Рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов (сайты узнавания) и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис.16), а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут как бы слипаться между собой в силу комплементарности. Примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично между нуклеотидами Г и А (рис.17). В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы соединяются водородными связями. Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы” (рис.17).

57

инициации определяется специальными регуляторными участками ДНК – промоторами. Терминация синтеза также происходит на специальных участках ДНК – терминаторах. В клетках бактерий РНК синтезируется сразу в зрелом виде

– в виде мРНК (матричная РНК), а у эукариотов – в виде предшественника мРНК, который должен подвергнуться процессингу – ферментативным превращениям, в результате которых образуется зрелая мРНК. Процессинг включает кэпирование (присоединение к 5’-концевому метилированному звену предшественника мРНК 7- метилгуанозина), полиаденилирование (присоединение к 3’-концу сегмента поли(А)), сплайсинг РНК (вырезание интронов и соединение экзонов – кодирующих последовательностей – в непрерывную последовательность).

Трансляция (мРНК белок) – многоступенчатый процесс синтеза белка согласно информации, заключенной в последовательности нуклеотидов мРНК. Трансляция осуществляется на клеточных органоидах - рибосомах, которые представляют собой нуклеопротеиды, в составе которых рибосомальная РНК (рРНК) и белок. При инициации происходит специфическое связывание рибосомы с мРНК и с первой аминоацил-тРНК, в результате чего образуется комплекс, способный к синтезу белка. При элонгации осуществляется последовательное связывание аминоацил-тРНК с образованием пептидных связей по программе, задаваемой последовательностью кодонов в мРНК. Терминация представляет собой отщепление готового белка от трансляционного комплекса. В ходе трансляции нуклеотидная последовательность мРНК считывается в направлении от 5’- к 3’-концу. Считывание происходит по законам генетического кода, согласно которым каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов (кодон), каждый кодон кодирует только одну аминокислоту, а последовательность кодонов

56

Таблица 3

Сравнение прокариотов и эукариотов

3.4.1. Грибы

Грибы́(лат. Fungi или Mycota) — особая форма жизни, царство живой природы, объединяющее эукариотические организмы, сочетающие в себе некоторые признаки как растений, так и животных. Они играют важную роль в биосфере, разлагая всевозможные органические материалы. Грибы – важнейшие продуценты в биотехнологии.

Изучение грибов – это предмет науки микологии. Грибы относятся к эукариотам, они растут в аэробных условиях и получают энергию путем окисления органических веществ, как и животные. Также они имеют клеточную оболочку, состоящую из хитина. С растениями их сближает ряд общих признаков: наличие клеточной стенки и вакуолей, заполненных клеточным соком, апикальный рост, хорошо видимое под микроскопом

37

движение протоплазмы, неспособность к активному перемещению. В отличие от растений грибы не способны к фотосинтезу и слабо дифференцированы морфологически, у них почти нет разделения функций между разными частями организма.

3.4.1.1.Строение и классификация грибов

Кгрибам относятся истинные слизевики (миксомицеты), низшие грибы (фикомицеты) и высшие грибы (собственно грибы или эумицеты) (Табл.3).Тело гриба состоит из тонких (диаметром около 5 мкм) нитей, называемых гифами, которые, переплетаясь, образуют мицелий. В зависимости от строения гифов грибы подразделяют на низшие и высшие (Рис.14).

Рис.14. Вегетативные гифы грибов: А –у фикомицетов гифы несептированные(не имеют поперечных перегородок); Б – септированные гифы эумицетов; В – у оомицетов гифы

разделены неполными перетяжками.

Гифы грибов растут путем удлинения кончиков (апикальный рост). Различают два способа размножения грибов – половое и бесполое. Большинство грибов размножаются обоими способами. Бесполое размножение осуществляется обычно при помощи спор, путем почкования или фрагментации. Наиболее широко распространено спорообразование. На концах гиф отшнуровываются конидиоспоры и дают начало новому организму.

38

был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.

Фундаментальной базой генной инженерии явились открытые ранее механизмы экспрессии генов, внехромосомные молекулы ДНК – плазмиды, ферменты, позволяющие проводить рекомбинацию генов.

1.Молекулярные механизмы матричного синтеза.

Подробно механизмы матричного синтеза (репликации, транскрипции и трансляции рассматриваются в курсе «Основы биохимии»). Здесь мы коротко приведем основные положения.

Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией ДНК (ДНК ДНК). Репликация осуществляется полуконсервативным путем на каждой из двух родительских цепей. Фермент - ДНК-зависимая ДНКполимераза – синтезирует нить ДНК, комплементарную родительской цепи (называемой матрицей), последовательно присоединяя к 3’-концу растущей цепи дезоксирибонуклеотиды, комплементарные дезоксирибонуклеотидам матрицы. В процессе репликации родительская двухцепочечная ДНК расплетается, образуя репликативную вилку. Для того, чтобы ДНК-полимераза могла начать синтез, необходимо существование готового фрагмента ДНК или РНК, комплементарного матрице и содержащего свободную 3’-ОН-группу. Этот фрагмент называют затравкой (праймером).

Процесс биосинтеза РНК в клетке называется транскрипцией ДНК (ДНК РНК). Транскрипция осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНКполимеразами, которые используют ДНК в качестве матрицы. Цепь РНК растет в направлении 5’ 3’. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы способны к самостоятельной инициации синтеза РНК. Место

55