Файл: 696.pdf

Половое размножение у грибов включает слияние двух ядер, образование зиготы и мейоз или редукционное деление, при котором число хромосом уменьшается до исходного (гаплоидного).

Наибольшее значение для биотехнологии имеют одноклеточные грибы – дрожжи и мицелярные – плесневые грибы.

3.4.1.2. Дрожжи Дрожжи - внетаксономическая группа

одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Объединяет около 1500 видов, относящихся к аскомицетам и базидиомицетам.

Дрожжи относятся к царству грибов (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes), наилучшие углеводные субстраты для них – сахароза, глюкоза. Дрожжи встречаются в природе всюду, где есть поддающиеся сбраживанию сахаристые соки – на фруктах, на листьях, цветках, содержатся в почве, водоемах, пищеварительном тракте человека. Большинство дрожжей – сапрофиты, но встречаются и патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикоза человека из рода

Candida.

Для дрожжей характерно бесполое размножение почкованием. При этом на материнской клетке образуется выпуклость – почка, в которую переходит 1 ядро, после чего почка отшнуровывается.

Дрожжи рода Saccharomyces способны к спиртовому брожению – в отсутствии кислорода они используют органические вещества в качестве акцепторов электронов и продуцируют этанол. В качестве источников углерода сахаромицеты утилизируют простые сахара, поэтому для использования доступных субстратов –

40

страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.

Альтернативой классической селекции в получении организмов с заданными свойствами является генетическая инженерия, предмет которой - рекомбинация хромосом или отдельных генов вне организма, в пробирке (in vitro). Таким образом, преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры. Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro.

Возможности генетической инженерии:

1.Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.

2.Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.

3.Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

Прежде, чем перейти к изучению основных методов генетической инженерии, целесообразно рассмотреть общие принципы процесса и специальную терминологию.

4.2.1.Теоретические предпосылки генетической инженерии

4.2.1.1. Термины и определения

Ген – структурная единица наследственности – участок ДНК, кодирующий структуру определенного белка или РНК.

Репликон - единица генома , способная к автономной репликации ДНК ; содержит точку инициации репликации. Экспрессия генов — это процесс, в котором наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок.

Транскриптон – участок ДНК, подвергающийся

53

б) Отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным фенотипом.

Фенотип (от греческого слова phaino - являю, обнаруживаю) - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития. Фенотип складывается в результате взаимодействия наследственных свойств организма (набора генов) – генотипа - и условий среды обитания. Этот метод используется, если известны пути синтеза и регуляции нужного вещества. Наиболее часто рассматривают следующие фенотипические варианты – морфологические изменения, резистентность к структурным аналогам метаболитов, резистентность к антибиотикам, наличие ауксотрофии (ауксотрофия - потеря организмом способности синтезировать те или иные вещества вследствие повреждения генов и появление у такого организма дополнительных питательных потребностей). У мутантов с определенным фенотипом вероятность появления сверхпродуцентов резко возрастает, что уменьшает трудоемкость селекционной работы.

4.2. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или продуцентов практически ценных микроорганизмов:

1)нельзя скрещивать неродственные виды;

2)нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

3)нельзя предугадать, какое получится потомство. Молекулярная биология вооружила ученых

пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на

52

крахмала, зерна – их гидролизуют ферметнами (амилазами).

Рис.15. Строение дрожжевой клетки: Кст – клеточная стенка; Мит – митохондрия; Ж – жировая капелька; ПМ – плазматическая мембрана; Яш – ядрышко;

ЭР – эндоплазматический ретикулум; П – гранулы полифосфата.

Д – диктиосомы, одна из форм аппарата Гольджи.

Спиртовое брожение лежит в основе таких промышленных процессов как виноделие, пивоварение, хлебопечение.

Дрожжи богаты белками, их содержание может доходить до 66 %, при этом 10 % массы приходится на незаменимые аминокислоты. Дрожжевая биомасса может быть получена на отходах сельского хозяйства, гидролизатах древесины, её выход не зависит от климатических и погодных условий. Поэтому её использование чрезвычайно выгодно для обогащения белками пищи человека и корма сельскохозяйственных животных.

Дрожжи Saccharomyces cerevisae и Pichia pastoris

успешно применяют в качестве систем экспрессии эукариотических белков в генетической инженерии.

41

3.4.1.3. Мицелиальные грибы

Важнейшими представителями мицелиальных грибов являются грибы родов Penicillium, Aspergillus и некоторые другие. Плесени продуцируют ферменты, используемые в промышленности (амилазы, пектиназы и другие), органические кислоты лимонную, глюконовую, щавелевую, итаконовую, фумаровую (Aspergillus niger) и антибиотики - пинициллины, цефалоспорины (грибы родов

Penicillium и Cephalosporium). Антибиотик гризеофульвин продуцирует нитчатый гриб Penicillium griseofulvum, антибиотик трихотецин – грибом Trichothecium roseum. Плесневые грибы применяют и в производстве сыров, например, камамбера и рокфора (грибы рода Penicillium),

соевого соуса (Aspergillus oryzae).

3.4.2. Простейшие

Простейшие (Protozoa) – это одноклеточные животные организмы, их рассматривают в курсах зоологии, но благодаря своим микроскопическим размерам они являются объектом микробиологии. Простейшие являются самими многочисленными представителями мира животных и характеризуются чрезвычайным разнообразием форм и поведения. Среди них есть и фотосинтезирующие организмы (эвглена), и хищники, поглощающие за счет фагоцитоза бактерии или других простейших. Некоторые из них быстро плавают в воде, другие – прикрепляются к другим объектам.

Практическое значение простейших связано с тем, что многие из них являются возбудителями болезней человека и животных, например плазмодий малярии, дизентерийная амеба. Для биотехнологии важно, что простейшие являются важнейшим компонентом активного ила (активный ил – естественно возникший биоценоз в аэрируемых очистных сооружениях - аэротенках и биофильтрах). Поглощая большое количество бактерий,

42

2. Подготовка исходного штамма к селекционной работе: ассе исходного штамма на чашки Петри, отбор колоний типичной формы с высокой продукцией целевого вещества.

3. Получение и отбор мутантов.

Мутагенами обрабатывают водные суспензии клеток в буферных растворах при оптимальном значении рН и заданном времени экспозиции. Дозу химического мутагена выбирают, ориентируясь на выживаемость микроорганизмов – отношение количества колоний, выживших после обработки мутагеном к контрольному количеству колоний, в %. Используют дозы, обеспечивающие выживаемость от 0,1 до 5-80%.

4. Отбор мутантов а) Отбор случайных (непредсказуемых) мутаций по

количественному признаку.

После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку. Работа эта требует больших трудозатрат и времени.

При открытии антибиотиков более 60 лет назад этот метод был единственно возможным. Классический пример такой селекции – получение современного продуцента пенициллина Penicillium chrysogenum с применением физических и химических мутагенов. Штамм, выделенный А. Флемигом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц пенициллина в 1 мл культуральной жидкости (КЖ). Воздействие УФ-излучения и алкилирующих агентов позволило в 1960 г. передать в производство штамм, продуцирующий 5000 единиц и более в 1 мл КЖ. Сейчас используют штаммы с продукцией более десятков тысяч единиц/мл.

51

2)повышение уровня синтеза и активности ферментов, участвующих в синтезе продукта; 3)блокирование синтеза побочных продуктов;

4)блокирование дальнейшего превращения продукта; 5)обеспечение экскреции (выделения) продукта из клетки.

Чаще требуется сочетание нескольких мутаций для сверхсинтеза продукта.

Мутации могут быть неконтролируемыми (спонтанными) и контролируемыми (индуцируемыми). Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106–108, чтобы возникала мутация. К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома в десятки и тысячи раз). Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ультразвук, ряд химических соединений. К последним относятся окислители, способствующие окислительному дезаминированию азотистых оснований (азотистая кислота, гидроксиламин, перекись водорода), азотистые основания, ингибирующие синтез нуклеиновых кислот и приводящие к ошибкам включения (2-аминопурин, 5-бромурацил, 5-аминоурацил), алкилирующие агенты (металлоорганические соединения, формальдегид, этиленимин, диметилсульфат, нитрозогуанидин, нитрозоэтилмочевина). Применяют и биологические мутагены – вирусы, биотоксины.

Основные этапы селекции

1. Выбор исходного штамма для селекции Выбирают природные продуценты нужных веществ

или микроорганизмы, не продуцирующие нужные вещества, но обладающие другими ценными свойствами.

50

простейшие способствуют выходу бактериальных экзоферментов, концентрирующихся в слизистой оболочке и тем самым принимать участие в деструкции загрязнений. В активных илах встречаются представители четырех классов простейших: саркодовые (Sarcodina), жгутиковые инфузории (Mastigophora), реснитчатые инфузории

(Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria).

Показателем качества активного ила является коэффициент протозойности, который отражает соотношение количества клеток простейших микроорганизмов к количеству бактериальных клеток. В высококачественном иле на 1 миллион бактериальных клеток должно приходиться 10-15 клеток простейших.

Простейшие обладают разнообразными биосинтетическими возможностями и потому широко распространенными в природе. Использование простейших в этом направлении уже началось.

3.4.3. Растения

Растения (царство Plantae) как объект биотехнологии рассматривает раздел биотехнологии – фитобиотехнология. В отличие от растениеводства – отрасли сельского хозяйства, фитобиотехнология оперирует с клетками и тканями растений, а также с биологически активными молекулами растительного происхождения. Интересно, что в культуре растительные клетки являются хемогетеротрофами.

Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Для культивирования используют клетки каллуса – неорганизованной массы дифференцированных растительных клеток.

43