ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 15.06.2019
Просмотров: 366
Скачиваний: 2
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2
ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОПРОБ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА
СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
1. ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ
1.1. Цель работы
Освоить метод спектрофотомерии в режиме прохождения света, ознакомиться с
оборудованием для проведения исследований. Исследовать оптические свойства биопроб
на основе полученных спектров. Определить концентрацию вещества в растворе с
помощью метода спектрофотометрии.
1.2. Используемое оборудование
1. Оптоволоконный спектрометр Ocean Optics USB 4000.
2. Дейтериево-вольфрамовый источник света (200-2000 нм) DT-MINI-2-GS
3. Оптоволоконные кабели (2 шт)
4. Коллиматоры (2 шт.)
5. Штатив для кювет с биопробой.
6. Кюветы с различной концентрацией перманганата калия KMnO
4
в воде.
7. Программа управления спектрометром SpectraSuite.
1.3. Программа работы
1. Ознакомиться с теоретическими основами измерения параметров биопроб,
законом Бугера-Ламберта-Бера.
2. Ознакомиться со структурной схемой спектрометра Ocean Optics USB 4000,
основными его частями и принципом управления.
4. Откалибровать спектрометр.
5. Измерить спектры пропускания биопроб.
6. Проанализировать полученные спектры. Определить концентрацию вещества в
каждом образце.
7. Составить отчет по работе.
1.4. Содержание отчета
1. Название работы.
2. Цель работы.
3. Приборы и материалы.
4. Программа работы.
5. Блок-схема установки на базе спектрометра.
7. Принцип работы спектрометра.
8. Полученные спектры пропускания и поглощения образцов. Анализ данных
спектров.
9. Расчет концентрации перманганата калия в воде для каждой из образцов пробы.
10. Вывод по работе.
2. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
2.1. Оптические методы определения параметров биопроб.
В основе большинства оптических методов исследования лежит взаимодействие
падающего света с исследуемой биологической средой, в результате которого изменяются
параметры светового потока.
Свет представляет собой электромагнитные волны. Электромагнитный спектр
излучения с длинами волн от 1·10
-11
до 3·10
-10
см условно разбит на отдельные области.
Излучения так называемой оптической области спектра простираются от
ультрафиолетовой области (УФ) радиации ~1,0 нм) до инфракрасных излучений (ИК) с
длиной волны до 1 мм:
1 Крайний УФ диапазон
1 –10 нм
2 Дальнее УФ излучение
10 – 200 нм
3 Ближнее УФ излучение 200 – 400 нм
4 Видимый свет
400 – 780 нм
5 Ближний ИК диапазон
780 – 2,5x10
3
нм
6 Среднее ИК излучение
2,5 – 50 мкм
7 Дальнее ИК излучение
50 – 1000 мкм
Границы диапазонов весьма условные.
Спектральный диапазон современных фотометрических приборов, работающих
медицинских лабораториях, как правило, ограничивается диапазоном видимого света,
ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона.
Границы диапазонов весьма условные.
Спектральный диапазон современных фотометрических приборов, работающих
медицинских лабораториях, как правило, ограничивается диапазоном видимого света,
ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона.
Классификация фотометрических методов
1. Классификация по спектральным характеристикам оптического излучения:
а) Фотометрические – методы, применяющие для исследования световой поток с
широким диапазоном длин волн.
б) Спектрофотометрические – методы, использующие световой поток с узким
диапазоном длин волн Δλ < 10 нм).
2. Классификация по виду взаимодействия вещества с излучением:
а) Абсорбционная фотометрия – методы изучающие поглощение светового потока
при его прохождении через биообъект.
б) Нефелометрия – методы изучающие рассеивание света в объекте.
в) Турбидиметрия – метод анализа мутных сред, основанный на измерении
интенсивности света прошедшего через исследуемый объект.
г) Рефлектометрия – метод анализа основанный на измерении интенсивности света
отраженного от исследуемого объекта.
д) Эмиссионная фотометрия – методы, изучающие излучение света веществом.
е) Люминисцентная фотометрия – методы, изучающие собственное свечение
вещества при его возбуждении различными способами.
3. Классификация методов по объектам исследования:
а) Методы исследования биопробы и жидкости (аналитические)
б) Методы, предназначенные для исследования организма.
Фотометрические методы исследования базируются на способности жидких сред
(растворов) или тканей поглощать и/или рассеивать, отражать электромагнитное
излучение и даже излучать электромагнитные волны под действием световой энергии или
в результате химической реакции.
На рис. 1 показано изменение интенсивности потока световой энергии при
прохождении света через раствор (а) и дисперсную среду (б) с толщиной поглощающего
слоя L, где:
I
0
– интенсивность падающего потока световой энергии;
I
от
– интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы;
I
п
– интенсивность потока световой энергии, поглощенной окрашенным раствором;
I
р
– интенсивность потока световой энергии, рассеянного дисперсной средой;
I – интенсивность потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого
вещества.
а
б
Рисунок 1. Явления, возникающие при прохождении а) через прозрачный
раствор, б) через дисперсную среду (пояснения в тексте).
Если не учитывать поглощение потока световой энергии стенками кюветы, то
интенсивность падающего светового потока I
0
при прохождении кюветы с раствором и
дисперсной средой разлагается на составляющие следующим образом:
I
0
=I
от
+ I
п
+ I – для раствора,
I
0
=I
от
+ I
п
+ I
р
+ I – для дисперсной среды.
В фотометрии I
от
, как правило, компенсируется или учитывается.
Рассмотрим подробнее наиболее часто используемые методы.
Метод абсорбционной фотометрии
В основу абсорбционного метода анализа положен обобщенный закон Бугера –
Ламберта – Бера.
Ниже рассматриваются явления пропускания и поглощения световой энергии.
Пропускание (Т) – это отношение интенсивности потока световой энергии I,
прошедшего через слой исследуемого вещества (рис. 2), к интенсивности падающего
потока световой энергии I
0
:
Т =I / I
0
.
Рисунок 2. Прохождение светового потока через кювету с раствором
Поглощение или оптическая плотность (D) – это величина, равная
D = lg(l/T) = lg(I
0
/I)
Согласно закону Бугера – Ламберта – Бера при облучении раствора монохроматическим
излучением с длиной волны λ, поглощение излучения D
λ
пропорционально концентрации
поглощающего вещества в растворе С (моль/г) и толщине поглощающего слоя L:
D
λ
=a
λ
CL,
где a
λ
– коэффициент поглощения, являющийся константой и характеризующий
поглощающие свойства вещества при данной длине волны λ.
Если концентрация раствора С выражена в молях на литр, то коэффициент поглощения а
λ
принято называть молярным коэффициентом поглощения и обозначать его как. ε
λ
. Закон
Бугера – Ламберта – Бера можно записать в других формах:
lg (I
0
/I) = ε
λ
L,
или
I = I
0
еxp(-ε
λ
L).
Важнейшим свойством при использовании абсорбционных измерителей является
аддитивность величины D
λ
, которая позволяет при исследовании растворов,
представляющих смесь «n» химически не реагирующих между собой веществ, записать:
где I
i
– интенсивность светового потока, прошедшего через раствор i-го компонента
смеси, D
λi
- величина оптической плотности i-го компонента раствора.
Величина пропускания Т обычно измеряется в процентах и меняется в диапазоне от 0 до
100%. Оптическая плотность D – оценивается в Беллах.
Чувствительность и погрешность фотометрического анализа во многом зависят от
правильного (оптимального) выбора длины волны, на которой производятся измерения, от
спектра поглощения исследуемого вещества в растворе, спектра поглощения
применяемых реактивов и спектра поглощения стандартных калибровочных растворов.
3. ОПИСАНИЕ УСТАНОВКИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ
РАБОТЫ
Для проведения лабораторной работы используется установка на базе
оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (рис. 1). Установка включает в себя
источник света Ocean Optics DT-MINI-2GS (рис.2) соединенный со спектрометром с
помощью оптоволоконных проводов (рис. 3) с использованием штатива для биопроб.
а
б
в
Рисунок 3. Спектрометр Ocean Optics USB4000 (а), источника света (б), и
оптоволоконный кабель (в) с разъемом SMA-905
Источник света DT-NINI-2GS излучает электромагнитные волны в УФ, видимом, ИК
областях спектра, которые попадают в 1-й оптоволоконный провод, к концу которого
присоединен коллиматор (рис. 4).
Рисунок 4 – Вид собранной установки (а) для исследования оптических свойств биопроб и
принцип функционирования оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (б).
Коллиматор позволяет равномерно осветить кювету с биопробой, после чего свет
ослабляется биопробой и попадает во второй коллиматор, который фокусирует световой
пучок на торец второго волновода. Затем свет из второго волоконно-оптического кабеля
попадает в спектрометр через разъем SMA 905.
На рисунке 5 показано прохождения света в спектрометре через ассиметричную
скрещенную схему Черни-Тернера, не имеющую подвижных частей, которые могут
подвергаться износу или ломаться.
Разъем SMA 905 (1) обеспечивает точное позиционирование конца оптического
волокна, а также является держателем входной щели (2) поглощающего фильтра (3).
Далее свет попадает на коллимирующее зеркало (4) и отражаясь от него попадает в виде
параллельного пучка на дифракционную решетку (5). Дифракционная решетка разлагает
свет на спектр, который попадает на фокусирующее зеркало (6), которое фокусирует
спектры первого порядка в плоскости детектора. Цилиндрические собирающие линзы (7)
установлены на детекторе фокусируют свет на более короткие элементы детектора, что
позволяет повысить эффективность собирания света. В качестве детектора применяется
линейная ПЗС матрица, состоящая из 3648 элементов. Конфигурация спектрометра
настроена на измерение спектра в диапазоне 350- 850 нм.
Рисунок 5. Схематическое изображение внутренних элементов спектрометра USB4000
Программа SpectraSuite (рис. 6), установленная на персональный компьютер позволяет
управлять работой спектрометра.