Файл: !Лабораторная работа №2 ТМД.pdf

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 15.06.2019

Просмотров: 379

Скачиваний: 2

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
background image

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 

ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОПРОБ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА  

СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ 

 

1. ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ 
 
1.1. Цель работы 
Освоить  метод  спектрофотомерии  в  режиме  прохождения  света,  ознакомиться  с 

оборудованием для проведения исследований. Исследовать оптические свойства биопроб 
на  основе  полученных  спектров.  Определить  концентрацию  вещества  в  растворе  с 
помощью метода спектрофотометрии. 

1.2. Используемое оборудование 
1. Оптоволоконный спектрометр Ocean Optics USB 4000. 
2. Дейтериево-вольфрамовый источник света (200-2000 нм) DT-MINI-2-GS 
3. Оптоволоконные кабели (2 шт) 
4. Коллиматоры (2 шт.) 
5. Штатив для кювет с биопробой.  
6. Кюветы с различной концентрацией перманганата калия KMnO

4

 в воде. 

7. Программа управления спектрометром SpectraSuite. 

 

1.3. Программа работы 

1.  Ознакомиться  с  теоретическими  основами  измерения  параметров  биопроб, 

законом Бугера-Ламберта-Бера. 

2.  Ознакомиться  со  структурной  схемой  спектрометра  Ocean  Optics  USB  4000,  

основными его частями и принципом управления. 

4. Откалибровать спектрометр. 
5. Измерить спектры пропускания биопроб. 
6. Проанализировать  полученные спектры. Определить концентрацию вещества в 

каждом образце. 

7. Составить отчет по работе. 

 

1.4. Содержание отчета 

1. Название работы. 
2. Цель работы. 
3. Приборы и материалы. 
4. Программа работы. 
5. Блок-схема установки на базе спектрометра. 
7. Принцип работы спектрометра. 
8.  Полученные  спектры  пропускания  и  поглощения  образцов.  Анализ  данных 

спектров.  

9. Расчет концентрации перманганата калия в воде для каждой из образцов пробы.  
10. Вывод по работе. 

 

2. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ 
2.1. Оптические методы определения параметров биопроб.  

В  основе  большинства  оптических  методов  исследования  лежит  взаимодействие 

падающего света с исследуемой биологической средой, в результате которого изменяются 
параметры светового потока. 

Свет  представляет  собой  электромагнитные  волны.  Электромагнитный  спектр 

излучения с длинами волн от 1·10

-11

  до  3·10

-10

  см  условно  разбит  на  отдельные  области. 

Излучения  так  называемой  оптической  области  спектра  простираются  от 
ультрафиолетовой  области  (УФ)  радиации  ~1,0  нм)  до  инфракрасных  излучений  (ИК)  с 
длиной волны до 1 мм: 


background image

 

1  Крайний УФ диапазон 

1 –10 нм 

2  Дальнее УФ излучение 

10 – 200 нм 

3  Ближнее УФ излучение  200 – 400 нм 
4  Видимый свет 

400 – 780 нм 

5  Ближний ИК диапазон 

780 – 2,5x10

3

 нм 

6  Среднее ИК излучение 

2,5 – 50 мкм 

7  Дальнее ИК излучение 

50 – 1000 мкм 

Границы диапазонов весьма условные. 
Спектральный  диапазон  современных  фотометрических  приборов,  работающих 

медицинских  лабораториях,  как  правило,  ограничивается  диапазоном  видимого  света, 
ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона. 

Границы диапазонов весьма условные. 
Спектральный  диапазон  современных  фотометрических  приборов,  работающих 

медицинских  лабораториях,  как  правило,  ограничивается  диапазоном  видимого  света, 
ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона. 

 
Классификация фотометрических методов 
1. Классификация по спектральным характеристикам оптического излучения: 
а)  Фотометрические  –  методы,  применяющие  для  исследования  световой  поток  с 

широким диапазоном длин волн. 

б)  Спектрофотометрические  –  методы,  использующие  световой  поток  с  узким 

диапазоном длин волн Δλ < 10 нм). 

 
2. Классификация по виду взаимодействия вещества с излучением: 
а) Абсорбционная фотометрия – методы изучающие поглощение светового потока 

при его прохождении через биообъект. 

б) Нефелометрия – методы изучающие рассеивание света в объекте. 
в)  Турбидиметрия  –  метод  анализа  мутных  сред,  основанный  на  измерении 

интенсивности света прошедшего через исследуемый объект. 

г) Рефлектометрия – метод анализа основанный на измерении интенсивности света 

отраженного от исследуемого объекта. 

д) Эмиссионная фотометрия – методы, изучающие излучение света веществом. 
е)  Люминисцентная  фотометрия  –  методы,  изучающие  собственное  свечение 

вещества при его возбуждении различными способами. 

 
3. Классификация методов по объектам исследования: 
а) Методы исследования биопробы и жидкости (аналитические) 
б) Методы, предназначенные для исследования организма. 
Фотометрические  методы  исследования  базируются  на  способности  жидких  сред 

(растворов)  или  тканей  поглощать  и/или  рассеивать,  отражать  электромагнитное 
излучение и даже излучать электромагнитные волны под действием световой энергии или 
в результате химической реакции. 

На  рис.  1  показано  изменение  интенсивности  потока  световой  энергии  при 

прохождении света через раствор (а) и дисперсную среду (б) с толщиной поглощающего 
слоя L, где: 

I

0

 – интенсивность падающего потока световой энергии; 

I

от

 – интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы; 

I

п

 – интенсивность потока световой энергии, поглощенной окрашенным раствором; 

I

р

 – интенсивность потока световой энергии, рассеянного дисперсной средой; 

I – интенсивность потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого 

вещества. 


background image

 

а 

б 

Рисунок  1.  Явления,  возникающие  при  прохождении  а)  через  прозрачный 
раствор, б) через дисперсную среду (пояснения в тексте). 

 

Если  не  учитывать  поглощение  потока  световой  энергии  стенками  кюветы,  то 

интенсивность  падающего  светового  потока  I

0

  при  прохождении  кюветы  с  раствором  и 

дисперсной средой разлагается на составляющие следующим образом: 

I

0

 =I

от

 + I

п

 + I – для раствора, 

I

0

 =I

от

 + I

п

 + I

р

 + I – для дисперсной среды. 

В фотометрии I

от

, как правило, компенсируется или учитывается. 

Рассмотрим подробнее наиболее часто используемые методы. 
Метод абсорбционной фотометрии 
В  основу  абсорбционного  метода  анализа  положен  обобщенный  закон  Бугера  – 

Ламберта – Бера. 

Ниже рассматриваются явления пропускания и поглощения световой энергии. 
Пропускание  (Т)  –  это  отношение  интенсивности  потока  световой  энергии  I, 

прошедшего  через  слой  исследуемого  вещества  (рис.  2),  к  интенсивности  падающего 
потока световой энергии I

0

Т =I / I

0

 

 

Рисунок 2. Прохождение светового потока через кювету с раствором 

 
Поглощение или оптическая плотность (D) – это величина, равная 

D = lg(l/T) = lg(I

0

/I) 

Согласно закону Бугера  – Ламберта – Бера при облучении раствора монохроматическим 
излучением с длиной волны λ, поглощение излучения D

λ

 пропорционально концентрации 

поглощающего вещества в растворе С (моль/г) и толщине поглощающего слоя L: 

D

λ

 =a

λ

 CL, 

где  a

λ

  –  коэффициент  поглощения,  являющийся  константой  и  характеризующий 

поглощающие свойства вещества при данной длине волны λ. 
Если концентрация раствора С выражена в молях на литр, то коэффициент поглощения а

λ

 

принято называть молярным коэффициентом поглощения и обозначать его как. ε

λ

. Закон 

Бугера – Ламберта – Бера можно записать в других формах: 


background image

lg (I

0

/I) = ε

λ

 L, 

или 

I = I

0

 еxp(-ε

λ

L). 

Важнейшим  свойством  при  использовании  абсорбционных  измерителей  является 
аддитивность  величины  D

λ

,  которая  позволяет  при  исследовании  растворов, 

представляющих смесь «n» химически не реагирующих между собой веществ, записать: 

 

где  I

i

  –  интенсивность  светового  потока,  прошедшего  через  раствор  i-го  компонента 

смеси, D

λi

 - величина оптической плотности i-го компонента раствора. 

Величина пропускания Т обычно измеряется в процентах и меняется в диапазоне от 0 до 
100%. Оптическая плотность D – оценивается в Беллах. 
Чувствительность  и  погрешность  фотометрического  анализа  во  многом  зависят  от 
правильного (оптимального) выбора длины волны, на которой производятся измерения, от 
спектра  поглощения  исследуемого  вещества  в  растворе,  спектра  поглощения 
применяемых реактивов и спектра поглощения стандартных калибровочных растворов. 
 

3.  ОПИСАНИЕ  УСТАНОВКИ  ДЛЯ  ПРОВЕДЕНИЯ  ЛАБОРАТОРНОЙ 

РАБОТЫ 

 
Для  проведения  лабораторной  работы  используется  установка  на  базе 

оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (рис. 1). Установка включает в себя 
источник  света  Ocean  Optics  DT-MINI-2GS  (рис.2)  соединенный  со  спектрометром  с 
помощью оптоволоконных проводов (рис. 3) с использованием штатива для биопроб. 

 

 

 

 

а 

б 

в 

Рисунок 3.  Спектрометр Ocean Optics USB4000 (а),  источника света (б), и 

оптоволоконный кабель (в) с разъемом SMA-905 

 
 
Источник света DT-NINI-2GS излучает электромагнитные волны в УФ, видимом, ИК 

областях  спектра,  которые  попадают  в  1-й  оптоволоконный  провод,  к  концу  которого 
присоединен коллиматор (рис. 4). 


background image

 

Рисунок 4 – Вид собранной установки (а) для исследования оптических свойств биопроб и 
принцип функционирования оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (б). 

 
Коллиматор  позволяет  равномерно  осветить  кювету  с  биопробой,  после  чего  свет 

ослабляется биопробой и попадает  во второй коллиматор, который фокусирует  световой 
пучок на торец второго волновода. Затем свет  из второго волоконно-оптического кабеля 
попадает в спектрометр через разъем SMA 905. 

На  рисунке  5  показано  прохождения  света  в  спектрометре  через  ассиметричную 

скрещенную  схему  Черни-Тернера,  не  имеющую  подвижных  частей,  которые  могут 
подвергаться износу или ломаться.  

 Разъем  SMA  905  (1)  обеспечивает  точное  позиционирование  конца  оптического 

волокна,  а  также  является  держателем  входной  щели  (2)  поглощающего  фильтра  (3). 
Далее свет попадает на коллимирующее зеркало (4) и отражаясь от него попадает в виде 
параллельного пучка на дифракционную решетку (5). Дифракционная решетка разлагает 
свет  на  спектр,  который  попадает  на  фокусирующее  зеркало  (6),  которое  фокусирует 
спектры первого порядка в плоскости детектора. Цилиндрические собирающие линзы (7) 
установлены  на  детекторе  фокусируют  свет  на  более  короткие  элементы  детектора,  что 
позволяет  повысить  эффективность  собирания  света.  В  качестве  детектора  применяется 
линейная  ПЗС  матрица,  состоящая  из  3648  элементов.  Конфигурация  спектрометра 
настроена на измерение спектра в диапазоне 350- 850 нм. 

 

 

Рисунок 5. Схематическое изображение внутренних элементов спектрометра USB4000 

 
Программа  SpectraSuite  (рис.  6),  установленная  на  персональный  компьютер  позволяет 
управлять работой спектрометра.