Файл: immunologia_N3-4_2010_block_210x297.pdf

ВВЕДЕНИЕ

Согласно современным эпидемиологическим исследованиям дисбиозом кишечника страдает около 90% всего населения земного шара. Дисбиоз кишечной микрофлоры является не только причиной, способствующей развитию различных патологических процессов в организме, но и в дальнейшем становится одним из факторов, обуславливающим тяжесть и продолжительность заболевания. Изменение количественного состава и качественного соотношения микроорганизмов в кишечнике чаще всего проявляется развитием синдрома пищеварительной недостаточности, который характеризуется диареей, неустойчивым стулом, запорами, желудочной и кишечной диспепсией, астеническим синдромом, протекающими на фоне формирующегося иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной склонности индивидуумов к аллергическим и инфекционным заболеваниям [1].

Как стало известно, наиболее частым проявлением иммунодефицита, развившегося на фоне дисбиоза кишечника, являются проявления вирусной инфекции [2]. В этой связи интересным представляется изучение характера влияния пищевых пробиотических продуктов, содержащих Lacto- и Bifidum бактерии на иммунологический статус здоровых лиц с целью выработки дальнейшей тактики лечения и иммунореабилитации больных с проявлением иммунодефицита [3].

Выяснилось, что дисбиоз кишечника может приводить к функциональному сдвигу системного клеточного иммунитета в сторону продукции цитокинов Th2 профиля и связанное с этим подавление функции Th1 клеток [4]. Как известно, сдвиг в сторону цитокинов Th2 профиля приводит к снижению продукции IFN- и снижению противовирусной и противоопухолевой защиты организма, а также способствует аллергизации [5]. Назначение диеты с дополнительным употреблением в пищу продуктов, содержащих Lacto- и Bifidum бактерии, приводит к снижению вредной микробной нагрузки на кишечник и создает условия для переключения синтеза цитокинов с Th2 на Th1профиль, что приводит к усилению резистентности организма к вирусной инфекции [6].

Патогенетическим обоснованием исчезновения иммунодефицитного состояния при нормализации биоценоза кишечника может служить также нормализация функционального взаимодействия между дендритными клетками (DC) и натуральными киллерными клетками (NК) в слизистой оболочке кишечника посредством регуляции синтеза цитокинов IL-12, IL-15 и IL-18 [7].

Появились новые данные, позволяющие предположить, что нормализация кишечной флоры приводит к повышению функциональной активности DC, расположенных в слизистой оболочке кишечника и способствует усилению активационных сигналов для NК клеток, под действием которых NК клетки активируют свою цитотоксическую функцию [8]. В последние годы это предположение все больше подтверждается новыми данными о роли таких активационных сигналов, которую способны исполнять IL-12, IL-15 и IL-18 в контексте взаимодействия между DC и NК клетками [9].

Однако остается непонятным факт влияния состава микрофлоры кишечника на характер локального и системного межклеточного взаимодействия.

В связи с этим, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии с секцией медицинской генетики Национального медицинского университета были проведены исследования влияния ежедневного приема пробиотического продукта Актимель на основные показатели иммунного статуса и функциональной активности мононуклеаров периферической крови у студентов в период интенсивного учебного процесса.

Цель исследования:

Основная цель работы состояла в том, чтобы подтвердить имеющиеся в литературе научные данные относительно положительного влияния пробиотического кисломолочного продукта питания Актимель на показатели врожденного иммунитета.

Задачи исследования:

1.Изучить кислород-зависимую (НСТ-тест) и NO-зависимуюфункциюклетокмоноцитарно- макрофагального ряда у студентов до и после употребления продукта Актимель.

2.Исследовать функциональную активность NK клеток периферической крови студентов по способности экспрессировать перфорин до и после употребления продукта Актимель.

3.Оценить динамику изменений цитокинового профиля (IL-12, IL-15 и IL-18) периферической крови у студентов под воздействием приема пробиотического продукта Актимель.

4.Изучить показатели системного иммунитета у студентов до и после употребления продукта Актимель.

ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий дизайн исследования

Исследование проводилось по ограниченной программе как открытое, сравнительное исследование влияния на состояние системного иммунитета студентов в условиях ежедневного приема продукта Актимель на протяжении 6 недель. Продукт принимался по 100 мл (2 бут.) в сутки. Эффект от приема исследуемого продукта оценивался по основным показателям состояния клеточного и гуморального иммунитета у студентов до и после приема.

Набор испытуемых

Из 200 студентов, добровольно изъявивших желание принять участие в исследовании, были отобраны 50 человек для формирования исследуемой группы.

Критерии включения в исследование

Студенты (поровну мужского и женского пола) с хорошим общим состоянием здоровья после ознакомления с условиями исследования и подписания информированного согласия

Критерии исключения

Прием препаратов обладающих иммуностимулирующим эффектом на протяжении 6 недель до начала исследования.

Регулярный прием Актимель и других пробиотических продуктов на протяжении 6 недель до начала исследования.

Хронические заболевания. Документально подтвержденная аллергия на

лактозу.

Прохождение стационарного лечения за 6 недель до начала исследования.

Критерии оценки Основные критерии:

–Общее состояние, аппетит и результаты академической успеваемости

Дополнительные критерии:

–Динамика системных иммунологических показателей: показатели иммунограммы (количество клеток CD3, CD4, CD8, CD19; концентрация sIgА и Ig Е;

–Функциональные показатели клеток моноцитарно-макрофагального ряда: NO и NST.

–Показатели количественных (CD16, CD56) и качественных (Perforin+) характеристик функциональной активности натуральных киллерных клеток (NK)

–Определение уровня цитокинов (IL-12, IL-15 и IL-18 ) в сыворотке крови

–Определение уровня кортизола в периферической крови

Критерии выбывания из исследования

Для каждого конкретного участника условиями прекращения приема продукта и выбывания из исследования являлись:

индивидуальная непереносимость продукта; возникновение в ходе исследования тяжелых

и/или неожиданных побочных явлений; клинически значимые отклонения лабора-

торных показателей; значительное ухудшение общего состояния

в период исследования; отказ от участия в исследовании.

График исследования

Исследование включало следующие этапы: 1й этап - скрининг 7 дней (период набора участников исследования, сдача анализов), 2й этап - период приема продукта - 42 дня, 3й этап – 50й день – повторная сдача анализов.

Регистрация данных проводилась по следующей схеме приведенной в таблице 1.

Таблица 1.

В период набора участников проводилось клинико-лабораторное обследование каждого потенциального субъекта исследования (скрининг), включающее:

демографические данные (возраст, пол); анамнез; клиническое обследование (АД, ЧСС, темпе-

ратура тела); общий анализ крови (эритроциты, гемо-

глобин, цветной показатель, лейкоциты, тромбоциты, СОЭ);

Все участники имели хорошее здоровье, что подтверждалось их анкетами, физическими данными и общими гематологическими анализами. Все студенты дали официальное письменное согласие на участие в данном экспериментальном исследовании, которое предварительно было одобрено местным Комитетом по медицинской этике.

Студенты, включенные в исследование, были распределены в основную исследуемую (50 человек) группу. Каждому субъекту исследования был присвоен порядковый номер, который соответствовал последовательности включения данного пациента в исследование. Порядковый номер был внесен в Индивидуальную регистрационную форму.

Схема приема продукта Актимель

Студенты (50человек) получали продукт Актимель содержащий специальный пробиотический штамм Lactobacillus casei DN-114 001 (108 КОЕ/мл) — коммерческое название casei DEFENSIS и две стандартные йогуртовые культуры Lactobacillus bulgaricus (107 КОЕ/мл) и Streptococcus thermophilus (108 КОЕ/мл) в дозировке 100 мл два раза в день до еды. Участников исследования опрашивали, как они выполняют требования исследования, и нет ли проблем со здоровьем, которые могли бы быть связаны с потреблением продукта. Потребление продукта Актимель в рационе питания контролировалось с целью оценки специфического влияния пробиотика именно на иммунную систему. Лабораторные и иммунологические показатели оценивались до начала исследования (7-й день) и по окончании 6-й недели приема пробиотического продукта (на 50-й день).

При проведении исследования исключалось назначение:

средств, обладающих иммуностимулирующим действием, иммунодепрессантов;

глюкокортикостероидов; препаратов, содержащих спирт.

Условия возможного прекращения исследования

Для каждого конкретного участника условиями прекращения исследования были: ин-

дивидуальная непереносимость исследуемого продукта, возникновение в ходе исследования тяжелых и/или неожиданных побочных явлений, значительное ухудшение общего состояния в период исследования, отказ от участия в исследовании.

Исследование должно было быть прервано в случае возникновения выраженных побочных эффектов в первые дни или часы испытания. О приостановке испытания исследователь должен был известить Заказчика.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунофенотипирование мононуклеаров периферической крови методом лазерной проточной цитофлуорометрии.

Мононуклеары периферической крови каждого участника исследования были выделены, используя стандартное центрифугирование в градиенте фиколл-изопак. Клетки промывали 3 раза буферным фосфатно-солевым раствором, ресуспендировали в фосфатном буфере, содержащем 2%-ную человеческую сыворотку и использовались для дальнейшего анализа.

Полученные мононуклеары периферической крови окрашивали в прямом одно и двухцветном иммунофлюоресцентном тесте. Использовали моноклональные антитела (МКА) из набора фирмы Becton Dickinson (CD3, CD4, CD8, CD16 и CD19), меченые флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (PE). Для контроля уровня неспецифического связывания коньюгатов МКА образцы окрашивали мышиными МКА против гемоцианина фиссуреллы (Keyhole limpet) субклассов IgG1 и IgG2а, мечеными соответственно FITC и PE. Иммунофенотипический профиль клеток изучали на проточном лазерном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, USA). Сбор данных и статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения LYSYSII Ver. 1.1 (Becton Dickinson), WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, La Jolla, CA) и Microsoft Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000.

Определение иммунофенотипа NKклеток, экспрессирующих перфорин, методом лазерной проточной цитофлуорометрии.

Для определения специфических маркеров натуральных киллерных клеток, мононуклеары периферической крови здоровых доноров окрашивали в прямом одно- и двуцветном иммунофлуоресцентном тесте. В исследовании использовали моноклональные антитела (мкАТ) (anti-CD56), меченные флюоресцеином (FITC) и (anti-perforin) , меченные фикоэритрином (РЕ).

Сбор данных и статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения LYSYS-II Ver.I.I.