Файл: immunologia_N3-4_2010_block_210x297.pdf

(Becton Dickinson), Win MDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, LA Jolla, CA, USA) и Microsoft Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000.

Иммуноферментный метод исследования концентрации цитокинов, иммуноглобулинов (sIg A, IgE) и кортизола в сыворотке

Концентрацию цитокинов, sIgA, IgE и кортизола в сыворотке крови исследуемых определяли при помощи иммуноферментного метода. Для определения содержания цитокинов использовали тест систему “INVITROGEN” (США), “Bender Medsystems” (США) и “Biosource” (США).

Тестирование проводилось при помощи иммуноферментного анализатора Stat Fax 303 Plus (США).

Определение содержания цитокинов, иммуноглобулинов (sIgA, IgE) и кортизола. В 96-луночные планшеты добавляли: по 100 мкл стандартов в соответствующие лунки для построения калибровочной кривой. В остальные лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Во все лунки добавляли по 50 мкл соответствующих антител. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, потом лунки 5 раз тщательно промывали буфером и удаляли остатки жидкости. Затем, в каждую лунку вносили по 100 мкл коньюгата (стрептавидин-пероксидазу), включая и “нулевую” пробу. После этого пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторяли промывку планшеты 5 раз и вносили во все лунки по 100 мкл TMB-субстрата хромогена. После инкубации в течение 12-15 минут останавливали ферментативно-субстратную реакцию, добавляя в каждую лунку по 100 мкл H2SO4. По окончании реакции проводили определение оптической плотности стандартов и образцов исследуемой сыворотки при длине волны 450 нанометров.

Для достоверной оценки результатов калибруется стандартная кривая, которая при построении должна быть линейной и указывать на прямо пропорциональный характер между уровнем концентрации цитокина, Ig G, M, A, E и кортизола в сыворотке и оптической плотностью. Данные анализа концентрации исследуемых веществ определяли путем их интерполяции с полученной кривой.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) для определения кислородзависимой функциональной активности мононуклеарных клеток

0,15% раствор НСТ готовим на изотоническом буфере, который содержит 100 мкг НСТ. Лейкоконцентрат получаем при помощи выделения на градиенте фиколл-верографин. Для

проведения теста используем несколько проб лейкоконцентрата по 1,5х106 кл/мл в каждой. Все пробы центрифугируем 10 мин. при 1500 об/мин. Надосадочная жидкость отбирается и к клеткам добавляется по 1 мл 0,15% раствора НСТ в каждую пробирку. Пробы инкубируются 1 час при 37°С, потом центрифугируются 10 мин. при 1500 об/мин. Отбирается супернатант и для травмирования клеток применяется 3-кратное замораживание-оттаивание. После оттаивания пробы центрифугируются 15 мин. при 3000 об/мин. (для осаждения диформазана). Результат учитывается на аппарате Stat Fax 303 Plus (США). Метод позволяет оценить кислород-зависимую функциональную активность мононуклеарных клеток (Пастушенков В.Л. и соавт. 1989) [10].

Определение уровня продукции NO для оценки активности моноцитарных клеток.

Для определения в лимфоцитах стабильного метаболита NO – нитрит иона – (NO2-) к 100 мкл супернатанта добавляли Greiss-реактив в аналогичном объеме (1:1) в качестве цветообразующего агента для оценки реакции. Greissреактив состоит из 1 части 1% сульфаниламида, 1 части 0,1% нафтилетиленамида и равной им по объему 5% фосфорной кислоты. После 10-минутной инкубации проводили определение оптической плотности стандартов (раститровка нитрита азота в культуральной среде) и образцов супернатанта на спектрофотометре при длине волны 492-630 нанометров.

Для достоверной оценки результатов стандартная кривая при построении должна быть линейной и указывать на прямопропорциональный характер зависимости между уровнем концентрации NO в супернатанте и единицами оптической плотности. Данные анализа проб относительно уровня синтеза оксида азота определяли путем их интерполяции с полученной кривой [11; 12].

Метод статистической обработки результатов.

Полученные данные обработаны статистически на персональном компьютере с помощью пакета программ “SPSS for Windows. Версия 11”. Математическая обработка полученных результатов проводилась с учетом проверки показателей на нормальное распределение за тестом Колмогорова-Смирнова. Для статистической обработки использовались параметрические критерии статистики - тест Стьюдента, а также критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферони. Обработка данных проводилась с помощью программы Excel. Для сравнения двух зависимых выборок использовали традиционный непараметрический тест Уилкоксона. Достоверной считали разницу при р<0,05.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Оценка состояния показателей врожденного иммунитета с помощью изучения кислород-зависимой (НСТ-тест) и NOзависимой функции клеток моноцитарномакрофагального ряда у студентов до и после употребления продукта Актимель.

Прогрессивное снижение иммунной функции, развивающееся на фоне стрессовых ситуаций, связано со снижением уровня сопротивляемости заболеваниям. По результатам различных исследований предлагается использование некоторых пробиотиков, тормозящих снижение иммунного статуса, связанное с присутствием хронического стресса. Продукты, содержащие пробиотики, оказывают несомненную пользу для здоровья людей. Примером может служить способность штаммов лактобактерий Lactobacillus casei к иммунномодуляции, проверенная на животных. Тем не менее необходимо проведение клинических испытаний, которые должны определить, как именно пробиотики влияют на неспецифические факторы защиты.

Ранее было отмечено, что при стрессовых ситуациях развивается дисфункция иммунной системы, которая, в общем, отражается на концентрациях иммуноцитов. Врожденная иммунная система проходит через эти изменения, отчасти обусловленные износом сигнальной межклеточной системы, связанным с хронической стрессовой нагрузкой. Исходя из этого, макрофаги теряют способность способностью к разрушению бактерий, а естественные киллеры

уже не могут так легко уничтожать опухолевые клетки и клетки зараженные вирусами.

Несмотря на то что некоторые люди имеют, несомненно, хорошее здоровье с высоким иммунным статусом, иммунная система многих людей вследствие воздействия хронического стресса реагирует на инфекции иначе. На основании этого положения проверено воздействие ежедневного потребления йогурта, ферментированного лактобактериями L. casei DN114001, на «респираторный взрыв» моноцитов и противоопухолевую активность естественных киллеров. Наблюдаемый в ходе эксперимента эффект от потребления пробиотика в обоих случаях оказался положительным.

В этой связи остается интересным изучение кислород-зависимой (НСТ-тест) и NOзависимой функции клеток моноцитарномакрофагального ряда до и после употребления продукта Актимель у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса.

1.1. Оценка динамика изменений показателей оксида азота до и после приема пробиотического продукта Актимель.

Установлено, что способность синтезировать NO из аминокислоты L-аргинин с помощью фермента NO-синтазы присуща макрофагам в ответ на бактериальные эндотоксины или провоспалительные цитокины.

На рис.1 представлена динамика изменения показателей оксида азота до и после приема пробиотического продукта Актимель.

90

80

70

60

50

До приема Актимель

После приема Актимель

Как видно из рисунка 1, у студентов до приема пробиотического продукта Актимель спонтанная секреция NO составляла в среднем 22,67±2,5 пкг/мл. Стимулирование стандартными митогенами ФГА и ЛПС повышало секрецию клетками NO и составляло 69,4±5,2 и 43,6±3,9 пкг/мл соответственно (р<0,001). После приема пробиотического продукта Актимель спонтанная секреция NO достоверно повышалась и составляла в среднем 38,1±2,9 пкг/мл.

Стимулирование стандартными митогенами ФГА и ЛПС достоверно приводило к более выраженному усилению секреции NO клетками и составляло 85,7±4,2 и 81,05±16,9 пкг/мл соответственно (р<0,001).

Резюме

Анализ данных позволяет заключить, что по окончанию приема пробиотического продукта Актимель происходит достоверное усиление продукции NO клетками у студентов исследуемой группы, превышающее продукцию NO до приема пробиотического продукта, что может косвенно подтверждать усиление NOзависимой функциональной активности клеток фагоцитирующего ряда.

1.2. Оценка динамика изменений показателей НСТ-теста до и после приема пробиотического продукта Актимель.

Оценка показателей активности окисли- тельно-восстановительных процессов во время фагоцитоза (НСТ-тест) представляет важную характеристику клеточного звена врожденного иммунитета.

На Рис 2. представлены результаты исследования клеток в НСТ-тесте до и после приема пробиотического продукта Актимель.

и составляли в среднем 0,145±0,02(ед. опт. пл.) (р<0,05).

Резюме

Проведенный анализ полученных данных позволяет заключить, что по окончанию приема пробиотического продукта Актимель происходит достоверное усиление показателей НСТтеста у студентов исследуемой группы, превышающее аналогичные показатели, зафиксированные до приема пробиотического продукта, что говорит об усилении кислород-зависимой функциональной активности клеток фагоцитарного ряда.

2. Исследование функциональной активности NK клеток периферической крови студентов по способности экспрессировать перфорин до и после употребления продукта Актимель.

Естественные киллерные клетки или натуральные киллеры (NК) представляют собой неоднородную субпопуляцию, которая в процессе эволюции приобрела большое значение для формирования врожденного и приобретенного иммунитета. Эти клетки занимают важное место

вподдержании иммунологического гомеостаза, непосредственно участвуя в уничтожении инфицированных вирусом клеток и опухолей. Как стало известно, основной путь уничтожения пораженных клеток связан с литической способностью ферментов (гранзимов), содержащихся

вгранулах NК. Однако для проникновения гранзимов в клетку-мишень необходимо наличие в гранулах NК перфорина, фермента, который нарушает мембрану клетки-мишени, что влечет за собой проникновение гранзимов и включение механизма апоптоза. В настоящее время одним из показателей активности NК-клеток служит экспрессия ими перфорина.

Известно, что стрессовые ситуации сопровождаются функциональными нарушениями клеточного иммунитета. При этом NK клетки, обеспечивающие противовирусный и противоопухолевый иммунитет у лиц, находящихся в состоянии хронического стресса заметно снижают свою функциональную активность. Было замечено, что употребление в пищу Lactobacillus rhamnosus или Bifidobacterium lactis в течение 3-х недель приводит к повышению количества NK -клеток и выраженному усилению их противоопухолевой активности. Существует предположение, что характер иммунного ответа и наличие дефицита функции NK клеток у соответствующих индивидуумов может быть скорректировано при помощи комплексной терапии с использованием пробиотических продуктов питания.

Вэтой связи представлялось интересным изучение влияния ежедневного приема пробио-

тического продукта Актимель на количество и функциональную активность NK клеток периферической крови по способности экспрессировать перфорин у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса.

Полученные изменения в показателях количества мононуклеаров периферической крови, способных экспрессировать маркер NK клеток CD16, CD56 и перфорин у студентов до и после приема продукта Актимель представлены на Рисунках 3 и 4.

Рис. 3. Уровень экспресии клетками маркера CD16+CD56+ NK клеток в крови у студентов до и после приема продукта Актимель по данным лазерной проточной цитометрии (в % Кл).

Рис. 4. Уровень экспресии перфорина CD56+ NK клетками крови у студентов до и после приема продукта Актимель по данным лазерной проточной цитометрии (в % Кл).

Исходя из данных приведенных на Рис.3, при проведении проточной цитофлуорометрии в крови студентов общая численность CD16+CD56+ NK клеток до приема продукта Актимель равнялась (17,06±0,88%) и достоверно не отличалась от аналогичных показателей, которые были получены после приема пробиотического продукта (15,2±0,6%).

Как видно из Рис. 4, в крови студентов исследуемой группы после приема продукта Акимель общая численность CD56+ натуральных киллерных клеток, экспрессирующих Перфорин равнялась (82,98±1,25%) и почти не отличалась от аналогичных показателей, которые наблюдались к концу приема прбиотического продукта (85,12±0,69%).

Резюме

Шестинедельный курс приема пробитического продукта Актимель не привел к достоверному изменению в периферической крови общей численности CD16+CD56+ NK клеток и количества CD56+ NK клеток экспрессирующих Перфорин у студентов находящихся в условиях интенсивного учебного процесса. Уровень указанных клеток колебался в пределах возрастной нормы.

3. Исследование динамики изменений цитокинового профиля (IL-12, IL-15 и IL-18) периферической крови у студентов под воздействием приема пробиотического продукта Актимель.

3.1. Оценка изменения показателя фонового уровня IL-12 в периферической крови у студентов принимающих пробиотический продукт Актимель.

Ключевую роль в иммунной системе слизистых играют дендритные клетки, которые относятся к так называемым «профессиональным» антиген-презентирующим клеткам и представлены во всех отделах желудочно-кишечного тракта. Они первые отвечают на внедрение патогенна в организм, активируя врожденный иммунитет, а затем регулируют развитие адаптивного Т-клеточного ответа, и в особенности поляризацию Тh1/ Th2 клеток.

IL-12 - один из важных цитокинов, продуцируемых макрофагами, дендритными клетками, от которого зависит форма специфического иммунного ответа. В его присутствии CD4+ Т-лимфоциты дифференцируются в воспалительные Т-клетки хелперы 1 типа (Тh1), которые начинают продуцировать и секретировать IL-2 и-ИНФ. Биологические эффекты IL-12 многообразны: от усиления пролиферации лимфоцитов и потенцирования действия IL-2 до активации естественных киллеров и индукции дифференцировки цитотоксических лимфоцитов.

При изучении влияния лактобактерий на продукцию дендритными клетками цитокина IL -12 было показано, что L.casei в наибольшей, а L.reuteri – в наименьшей степени способны к стимуляции IL-12. Установлено, что инкубация клеток кишечного эпителия с лакто- и бифидобактериями, характерными для раннего детского возраста, снижают продукцию провоспалительного цитокина IL-8, индуцированного